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应用研究
特异鲎试剂研究进展（综述）
Date: 2017-07-19 11:05:38
夏振民 刘大英
（中国药品生物制品检定所 北京 100050）
（中国药品生物制品检定所 北京 100050）
自从1981年日本学者Kakinuma A等报道“一种抗癌物质（1-3）-β-D-Glucan 可使鲎试剂凝聚”以来，由于其涉及鲎试的特异性，引起各国学者的注意。经过10多年来的基础研究与实践，目前对其本质、来源、与鲎试剂反应机理以及克服方法，已经了解得相当深入。中国特异鲎试剂的研究、生产和实际应用也开始起步，为促进这一工作的发展，将有关文献报道，简要综述如下：
一、（1-3）-β-D-葡聚糖的本质与来源
Kakinuma A等在作抗癌物质葡聚糖热原试验时，不含发热物质的葡聚糖能引起鲎试验呈阳性反应。Loretta A和Pearsen FC也报道，血液透析器上存在鲎试验反应物质（LAL-Reactive Material LAL-RM），以后有报道凡经过铜铵人造丝透析膜的制品，均存在使鲎试验阳性，但不是内毒素的物质。除（1-3）-β-葡聚糖外，（1~4）、（1~6）-β-葡聚糖同样使鲎试验产生阳性结果，这些物质的总称为真菌多糖（Fungal polysaccharide），普遍存在于真菌细胞壁。如果这类物质具有像内毒素一样的致热活性，细菌内毒素检查和热原检查结果的符合率会接近一致。但是恰恰相反，真菌多糖似乎不是一种致热物质，文献报道1.0、0.01、0.0001mg/ml的真菌多糖溶液，剂量按10ml/kg，进行热原试验的结果，3h内3只家兔最高升温的均值分别为0.23±0.03,0.13±0.09,0.20±0.10。这将导致在使用普通鲎试剂检测某些样品时，出现细菌内毒素检查不合格，热原检查合格的现象。造成对这些物质热原检查的错判。1990年Ikemura K等将鲎试验反应机理和各种干扰内毒素检查物质及干扰部位归纳如图。
鲎试剂反应机理和干扰内毒素检查物质及干扰部位
由此可知，鲎试剂检测内毒素出现非特异结果是不奇怪的。为了使细菌内毒素检查与热原检查的结果趋向一致，使用特异鲎试剂是完全必要的。
二、特异鲎试剂制备
1968年Levin J和Bang F B创建鲎试剂以来，使内毒素的检测成为灵敏、快速、简便的方法，已被举世公认，并被美、日、中、欧洲药典以《细菌内毒素试验》收载，但是由于上述非特异性的存在，使这一试验的实际应用受到一定限制。为了克服这一弊端，各国学者进行了深入研究。由于上述鲎试验反应机理已被阐明，设法阻止右侧旁路反应，便能使鲎试剂对内毒素的检测达到特异性的目的。
日本最先推出的特异鲎试剂其商品名为Endospecy，其生产工艺的特点是将普通鲎试剂中存在的G因子，以亲和层析方法分离去除。国内有人称无（弃；去）G因子鲎试剂。显然，鲎试剂中没有G因子，即使被测样品中存在真菌多糖（非内毒素），也不能产生活化的G因子，在反应旁路系统中就不能激活凝集酶原，旁路反应被阻断，使成为对内毒素具有特异性。国内有人报道，以同样方法制备了仅含C、B因子的鲎试剂。但是以这种工艺制备的特异鲎试剂，由于在分离G因子的过程中，必需防止带入微量内毒素，即所用分离试剂、柱床、器皿及操作过程，严防内毒素污染，不仅增加了制备工艺的难度，也必然增加了鲎试剂的成本，因此很难推广应用。
1989年Berzofsty R N报道，在制备普通鲎试剂时，为了提高检测内毒素的灵敏度，均采用氯仿提取存在于鲎试剂粗制品中的抗LPS（脂多糖）因子。氯仿提取的结果确实增加了鲎试剂的灵敏度，但同时将存在于鲎试剂粗制品中的抗G因子一同除去，这就使普通鲎试剂易被真菌多糖激活，增加了普通鲎试剂的非特异性。因此提出不用氯仿提取，改用一种特殊试剂（专利），只除去抗脂多糖因子，而保留抗G因子，以达到即增加了对内毒素的敏感性，又消弱了真菌多糖活化G因子的能力。这是从鲎试剂的生产工艺上进行改革，实现提供商品特异鲎试剂的一种方法。
1990年Tsuchiya M报道，由于真菌多糖与普通鲎试剂反应形成凝胶，有一个特定浓度范围（10-3-10-6mg/ml），大于或小于这个浓度都不能形成凝胶，故在制备普通鲎试剂的基础上，加入过量的真菌多糖（1mg/ml），可阻止G因子的活化，即“封闭”了旁路，达到制备特异鲎试剂的目的。显然采用这一措施制备的特异鲎试剂，较以上两种方法即简便又经济，可使特异鲎试剂商品化。
三、特异鲎试剂的应用
内毒素是药品污染热原的主要原因，在GMP条件下生产药品的热原控制，无内毒素即无热原，这是药典普遍采用《细菌内毒素检查法》代替《热原检查法》的依据。但是，某些药品特别是血制品，由于其生产工艺中，一般需经过纤维素膜过滤，使污染Glucan样物质的机会增加。藤原博等以普通鲎试剂和特异鲎试剂检测商品血制剂（白蛋白、球蛋白）内毒素含量，并与热原检查结果比较，实验表明，使用普通鲎试剂阳性检出率高于特异鲎试剂，而后者的阳性检出率与热原检查相符。同时作者向血制剂中添加内毒素后，再用两种鲎试剂测定内毒素的含量，结果普通鲎试剂检出量远高于添加量，而特异鲎试剂检出量与添加量基本一致。作者还以两种鲎试剂检测了精制吸附百白破三联菌苗，并与家兔升温曲线相比较，结果无大差别，说明精制吸附百白破三联菌苗不像血液制品含样β-Glucan物质，认为血液制品的内毒素检测，使用特异鲎试剂可以与家兔热原检测得到十分一致的结果。Ikemura K等以普通和特异鲎试剂显色基质法，定量测定经静脉注射免疫球蛋白治疗患者的血浆和尿中内毒素，血浆中鲎试验反应物的含量随给患者的免疫球蛋白量成比例增加，多次使用该反应物在血中累积，从尿中排出的量不足5%。该反应物很可能来自生产血制剂时使用了纤维素膜。作者认为，对接受免疫球蛋白患者进行血中内毒素测定时，对测定结果的解释应给予特殊考虑。池屯胜美等对肾功能不全进行血透析患者的血中内毒素定量测定，使用普通鲎试剂显色基质法经常出现阳性结果，但病人并未出现发热和白细胞增加，经过对人工透析膜进行检查，证明用铜铵人造丝膜有鲎试验反应物游离，而用特异鲎试剂显色基质法时，阳性检出率很低，说明这些鲎试验反应物不是内毒素，而是可以活化G因子的物质。由于中国特异鲎试剂不久即将商品化，目前应用报道廖廖，但笔者确信随着细菌内毒素检测工作的深入开展和对鲎试验反应机理认识的深化，特异鲎试剂的应用将方兴未艾。
《药物分析杂志》第17卷第5期
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