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应用范围
细菌内毒素限量检查法试验介绍
Date: 2018-10-20 15:13:23
韦冬苗（讲解） 董光宴（审校）
（湛江博康海洋生物有限公司，湛江524094）
一、试剂
1、鲎试剂：
- 具有国家批准文号，并依法检验合格。 如：湛江博康海洋生物有限公司，卫药准字（88）SJ-04。
- 鲎试剂一般按标示温湿度贮藏。湛江博康海洋生物有限公司提供的鲎试剂贮藏条件为，温度：25℃以下，建议湿度45%～70%，也可以贮藏在2℃～10℃的冷处，但建议试验前2小时将鲎试剂移至室温环境；避免将鲎试剂贮藏在湿度小于45%的环境中，这种环境玻璃安瓿易产生静电，吸附鲎试剂粉末，导致鲎试剂粉末无法全部落入瓶底。
2、细菌内毒素检查用水：
- 鲎试剂生产厂家配套，要求其pH值应在5.0～7.0之间，检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水；
- pH值应在5.0～7.0之间；
- 与相同厂家的鲎试剂、细菌内毒素工作品配套使用；
- 细菌内毒素检查用水贮藏在常温。
3、细菌内毒素标准品：
- 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。中国食品药品检定研究院提供，如：150800-201601，活性单位：9000EU/支。
- 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。中国食品药品检定研究院提供，如：150601-201784，活性单位：80EU/支。
- 细菌内毒素工作品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中阳性对照和样品阳性对照。湛江博康海洋生物有限公司生产， 如：1809200，活性单位：10EU/支。
注意：
- 细菌内毒素标准品的开启只能在安瓿的易折点上部开启内毒素，不能沿易折点开启，防止振荡过程中内毒素溶液与封口膜接触，污染标准品溶液。
- 只能取1ml的细菌内毒素检查用水复溶细菌内毒素工作标准品。
- 若使用的为细菌内毒素国家标准品，可按其使用说明书中的方法将其稀释至规定浓度后分装保存（浓度为9000EU的细菌内毒素标准溶液在4℃条件下可保存7天；或者将复溶后的细菌内毒素标准溶液制成2000EU/ml，每0.3ml分配于除去外源性内毒素的试管中，用封口膜将管口封严，管口垂直向上，然后立即贮藏在-20℃冰箱中可保存3周。）。若为细菌内毒素工作标准品，为一次性使用，不得分装保存。
- 错误使用：使用内毒素工作标准品标定鲎试剂灵敏度；使用厂家的内毒素复核鲎试剂灵敏度；厂家内毒素交叉复核鲎试剂灵敏度；使用厂家的内毒素做干扰实验。
- 稀释后的细菌内毒素溶液静置时间超过10分钟，再用前在旋涡混合器上振摇1分钟，放置4小时以上的内毒素溶液应丢弃。稀释后的细菌内毒素溶液效价较低，由于保存不当或保存的容器未除热原等，内毒素溶液容易被污染。同时，细菌内毒素溶液长期放置其效价通常会下降，因此再次使用时，实验结果可能会有偏差，不建议保存后在使用。
- 细菌内毒素工作标准品如标示有效期，在效期内使用；中国食品药品检定研究院提供的细菌内毒素国家标准品150800-201601未标示有效期，按国家文件要求使用；中国食品药品检定研究院提供的细菌内毒素工作标准品未标示有效期，建议2年内使用。
- 细菌内毒素标准品一般按标示温度条件贮藏，建议所有细菌内毒素标准品贮藏在-10℃以下。
二、试验器材
1、玻璃移液管（或吸嘴）和玻璃试管 建议大家选用本公司提供的一次性耗材。无热原耗材是一种在此行业中被鉴定为无内毒素和β-葡聚糖污染的产品，其中包括, 无热原试管、无热原移液器吸头。这些产品可以给您的工作带来很大方便,另外，当实验出现误差时可首先排除器皿方面的因素,很快分析判断出误差原因。自行处理玻璃移液管和玻璃试管按以下要求和规程处理：2015年版《中国药典分析检测技术指南》细菌内毒素检查法“3 实验准备”规定：
- 3.1.1 玻璃器皿的洗涤 将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置入烤箱。
- 3.1.2 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素 玻璃器皿置烤箱后，将烤箱调至 250℃，待烤箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤30分钟以上。达到规定时间后，关断电源，待烤箱温度自然降至室温。在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。
按照2015年版《中国药典》凡例第二十二条规定“试验用水，除另有规定外，均系指纯化水。”应该特别注意，该规程明确规定最后冲洗玻璃器皿必须“用蒸馏水冲洗。”有的客户使用反渗透制备的纯化水冲洗试验用玻璃器皿，结果试验中所有的阳性对照都为阴性，复核鲎试剂灵敏度时试验结果误差较大，这主要是由于纯化水和蒸馏水的制备方法不同所造成的。由于制备方法不同，纯化水中存在的阴阳离子经250℃高温干烤不可能被破坏，这些离子对鲎试剂酶反应有较强的抑制作用。
- 常见错误：部分客户使用纯化水冲洗试验用玻璃器皿，更有甚者居然只用自来水冲洗，然后干烤以除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素。这样处理玻璃器皿做细菌内毒素实验的主要现象：阳性对照不成立，灵敏度复核结果也不成立。这是目前所知阳性对照不成立和灵敏度复核结果不成立的主要原因。
- 解决办法：取一个洁净的盆用蒸馏水反复冲洗，洗净后盛一盆蒸馏水将“用自来水洗净”的玻璃器皿放入盆中，反复冲洗，这样为冲洗一遍，洗完后将水倒净另盛一盆蒸馏水重洗，如此冲洗最少三遍。为了保证试验结果的准确性和检验报告的权威性，我们应该严格遵守操作规程，用蒸馏水冲洗鲎试验用玻璃器皿。
2、恒温箱
目前常用的恒温箱为水浴箱和干式恒温箱，能准确控制温度二者都可以使用。推荐一款小巧轻便的干式恒温仪ET-96内毒素凝胶法测定仪，该仪器采用固体铝板加热；提供96个检测孔，可直接插入鲎试剂安瓿，也可插入试管；96个检测孔分为12组，单独计时；温度控制精确0.1℃。无论采用哪种恒温箱，鲎试剂都必须用医用胶布或封口膜封口，鲎试剂不得敞口放置入恒温器内。封口的目的是为了防止放置灰尘、水滴等落入鲎试剂内造成污染，同时也为了防止鲎试剂安瓿内水分的挥发，避免假阳性的产生。禁止使用生化培养箱作为细菌内毒素试验的恒温箱，避免假阴性的产生。
3、旋涡振荡器。
4、其它：消毒棉球、试管架、剪刀和封口膜等。
三、抽样
在配制罐或灌装前的储罐中的药液的微生物和内毒素污染可视为均匀的，但经过灌装后，就有可能存在污染不均匀的情况。
无菌（或内毒素）检査的样品除另有规定外，一般采取随机抽样原则进行取样。随机抽样中，对分批应特别注意。对于一个配制批次分多个灭菌柜/次灭菌的情况，通常应对各个灭菌柜/次分别取样，进行无菌（内毒素）检查。限于抽样原理，无菌（内毒素）检查无法有效发现低污染概率的缺陷，在遵循随机取样的原则下，还应考虑产品生产工艺、无菌检查法的特点及微生物污染的方式，抽取典型产品组成样本进行检验。
四、环境要求
2010年版药品GMP实施指南要求细菌内毒素实验室：温度18～26℃，湿度45%～75%。为保证实验结果的准确性，防止污染，内毒素检查实验应在密闭的洁净室中或密闭实验室的超净工作台下进行。
1、密闭的洁净室中或密闭实验室的超净工作台
细菌内毒素检测人员应经过严格的培训，并应配备相应的防护设施（如穿防护服、戴口罩、头套等）。超净工作台尽可能选择水平气流式工作台，注意消毒剂的影响。
2、实验室温度
将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水稀释成2λ，进行鲎试验，然后分别放置于25、28、31、34、37℃水浴保温。实验中观察到凝胶形成的速度随着温度的升高而加快。从实验可以看出，温度对鲎试剂的灵敏度影响很大，保温温度在25～37℃之间，随着温度的升高，反应速度也升高。
将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水稀释成2λ，进行鲎试验，37℃保温，分别在10、20、30、40、50、70min时观察，发现凝胶的形成状态随着时间的延长而坚固。
因此夏天室温较高，如果试验操作时间太长，细菌内毒素与鲎试剂混合液不等进入反应仪器反应已开始，实际反应时间超过1小时。由于室温不同，冬夏季节、南北地区之间的操作误差将会很大，即使在25℃准室温下操作，操作时间拖得过长，细菌内毒素含量较高时，测定误差也不会小。
3、实验室湿度
鲎试剂是一种无菌冻干产品，这类产品有一明显特性即吸潮。当实验室湿度大于80%时，鲎试剂开启后较易吸潮，空气中水分内含有何种成份无法预知，吸湿后可能产生何种影响也无法预知。根据经验，当空气湿度较大时，鲎试剂灵敏度复核值要大于标示值，标示值为0.25EU/ml的鲎试剂复核结果可能高于0.125EU/ml，有时甚至达到0.06EU/ml。当空气湿度较小低于40%时，鲎试剂安瓿内溶液较易挥发，造成细菌内毒素浓缩，产生假阴性结果。这也是我们要求使用干式恒温箱时，鲎试剂必须封口的原因之一。
五、供试品溶液的制备
1、供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
第一类、易溶注射用无菌注射药（固体）或无菌原料药。
- 固体类可溶性无菌原料药为了保证取样的科学性、准确性和代表性，称样量应大于100mg。
- 无菌原料药需要检测内毒素时，为了检验结果与生产工艺一致，必须依照标准扣除水分和杂质。
- 注射用无菌注射药加适量细菌内毒素检查用水溶解稀释即可。
第二类、注射用无菌注射药（液体）。
- 直接用细菌内毒素检查用水稀释即可。
第三类、微溶或不溶性注射用无菌注射药（固体）
- 参照2015版《中国药典》正文P1462《酪氨酸》检查项【细菌内毒素】执行。
- 难溶性固体药品为了保证取样的科学性、准确性和代表性，称样量应大于1g。
- 难溶性固体药品为了建立细菌内毒素检查方法，可以采用以下几种方法：
- ① 洗涤法，取上清液依法检测，如酪氨酸等；
- ② 超声波助溶法，如放线菌素D、注射用放线菌素D等；
- ③ 加热助溶法，如苯丙氨酸、色氨酸等；
- ④酸碱互溶法，如酸性哌拉西林用1mol/L氢氧化钠溶液适量使溶解等。
第四类、医疗器械
按照国标GB/T 14233.2-2005《医用输液输血、注射器具检验方法》要求：根据产品标准规定的细菌内毒素限值确定浸提介质体积，选用下列适宜方法制备供试液：
- a）管类和容器类器具用细菌内毒素检查用水浸泡器具内腔，在（37±1）℃恒温箱中浸提不少于1h；
- b）小型配件或实体类器具置无热原玻璃器具内，加入细菌内毒素检查用水振摇数次，在（37±1）℃恒温箱中浸提不少于1h。
企业生产实验用器具器皿可参照此标准执行。
2、确定最大有效稀释倍数
举例：
1、硫酸妥布霉素注射液：C= 40mg/ml，L= 2.0EU/mg(2015年版《中国药典》P516)
1、硫酸妥布霉素注射液：C= 40mg/ml，L= 2.0EU/mg(2015年版《中国药典》P516)
当用灵敏度为0.125EU/ml 的鲎试剂时：
MVD=（40×2）/ 0.125
=640倍
2、右旋糖酐70葡萄糖注射液 L= 0.50EU/ml(2015年版《中国药典》P171)
当用灵敏度为0.125EU/ml 的鲎试剂时：
MVD=（1.0× 0.50）/0.125
=4倍
3、头孢噻肟钠（原料）：水份＜6%，含量≥86%，L= 0.05EU/mg(250年版《中国药典》P297)
当用灵敏度为0.125EU/ml 的鲎试剂时：称得样品126.8mg
最小有效稀释浓度c=λ/L
=0.125/0.05
=2.5mg/ml
计算纯头孢噻肟钠的量：
= 126.8mg×(1-6% ) × 86%
=106.60mg
用5.33ml的BET水复溶，得浓度C=20mg/ml，在此基础上稀释8倍即可。
六、鲎试剂灵敏度复核试验
1、做鲎试剂灵敏度复核试验的目的？
答：2015版《中国药典》规定“当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。”2015版《中国药典分析检测技术指南》规定“鲎试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考查检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。”
因此要求每个实验室在使用一批新的鲎试剂进行供试品干扰实验或供试品细菌内毒素检查前必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。 细菌内毒素国家标准品与细菌内毒素工作标准品之间或细菌内毒素工作标准品与细菌内毒素工作标准品之间的生物效价存在一定的误差，用不同细菌内毒素标准品复核同一批鲎试剂灵敏度时可能存在一定的误差。
中国药典要求“当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。”试验结果只要在这合格范围内表示鲎试剂标示灵敏度准确。
2、操作
2.1、试剂
- 鲎试剂（生产单位：湛江博康海洋生物有限公司；批号：1808272；灵敏度：0.125EU/ml；规格：0.1ml/支）
- 检查用水（生产单位：湛江博康海洋生物有限公司；批号：1808200；规格：5ml/支）
- 细菌内毒素工作标准品（活性：80EU/支；批号：201784；中国食品药品检定研究院提供）
2.2、操作
2.2.1细菌内毒素标准溶液的制备
取细菌内毒素工作标准品（201784）一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75％酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。
按照标准品说明书,加入规定量的细菌内毒素检查用水1.0ml溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液,即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ（0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.0625EU/ml和0.03125EU/ml，λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟（详细过程请参见标准品使用说明书）。
2.2.2 待复核鲎试剂的准备
取规格为0.1ml/支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75％酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，取若干支按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混和在一起，然后每0.1ml分装到10mm×75mm凝集管中，要求至少分装18管备用。
2.2.3 加样
将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），每支分别加入0.1ml 2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液；1列2支（管），每支分别加入0.1ml检查用水。
2.2.4 加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60分钟±2分钟。
2.2.5 观察并记录结果。将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180°观察，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（＋）；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为（-）。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
2.3 实验结果计算
如最大浓度 2.0λ 4管均为阳性，最低浓度 0.25λ 4管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果（λc）
λc=antilg( X/4 )
式中X为反应终点浓度的对数值（Lg）。反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。
2.4 结果判断
当λc 在0.5λ～2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，并以λ（标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。
设待复核鲎试剂的灵敏度为0.125EU/ml。实验结果如下：
λc=antilg( X/4)
=antilg(lg0.125+lg0.125+lg0.125+lg0.0625)/4
= 0.10( EU/ml)
λc 在0.5λ～2.0λ范围内，符合规定。并且该批鲎试剂的灵敏度为标示灵敏度0.125EU/ml。
※ 鲎试剂灵敏度复核试验结果全部为阴性主要有三个方面的原因祥见本书《阳性对照不成立的原因分析及解决方法》。
七、限量检查
例如:右旋糖酐70葡萄糖注射液 L= 0.50EU/ml(2015年版《中国药典》P171),最大有效稀释倍数MVD为4倍，TAL（0.125EU/ml）。
1、 按要求制备阳性对照、阴性对照、样品管和样品阳性对照。
2、制备方法
首先，将样品右旋糖酐70葡萄糖注射液稀释到2倍、4倍备用。
2.1、供试品阳性对照PPC：（做2管）
取右旋糖酐70葡萄糖注射液的2倍稀释液和浓度为0.50EU/ml的内毒素稀释液各0.3ml混合均匀，取该混合液0.1ml加入已经复溶好的鲎试剂中即可。
2.2、阳性对照PC：（做2管）
取0.1ml浓度为0.25EU/ml的内毒素稀释液加入已经复溶好的鲎试剂中即可。
2.3、供试品溶液：（做2管）
取0.1ml右旋糖酐70葡萄糖注射液的4倍稀释液加入已经复溶好的鲎试剂中即可。
2.4、阴性对照：（做2管）
取0.1ml细菌内毒素检查用水加入已经复溶好的鲎试剂中即可。
3、结果判断
保温60分钟±2分钟后观察结果。若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。
（本文完）
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