周仁荣 染 兵
1 解放军81医院消化科 江苏省南京市 210002
2 第四军医大学西京医院 现在澳大利亚墨尔本医学中心 陕西省西安市 710033
*参加1996年罗马欧州肝病会议交流
项目负责人 周仁荣 解放军81医院消化科 江苏省南京市 210002
收稿日期 1999-02-01
Subject headings cell culture/mice; hepatocytes; endotoxin
主题词 细胞；培养；鼠/肝细胞；内毒素
离体鼠肝细胞培养的建立，为进一步研究异常状态下肝细胞相关功能的变化奠定了基础. 我们采用同一质量浓度的内毒素(E. ColiO111 B4)对离体肝细胞进行攻击，观察其被内毒素攻击后肝细胞相关功能的变化与其离体细胞培养时间长短之间的关系，探索其选择最佳培养天数的鼠肝细胞。
1 材料和方法
取1日龄～3日龄的昆明鼠，麻醉后取其肝脏，经冲洗然后被胰酶消化. 置DMEM应用液中，在37℃，50mL/L CO2孵箱中培养. 培养一段时间后，取其原代细胞，再用2∶1 胰酶EDTA消化，D-Hanks液洗，计数活细胞(2×1011/L)分瓶培养. 不同培养天数的(分别培养15，16，17，18，19d，每一培养天数设两瓶)离体鼠肝细胞，各自被同一质量浓度的内毒素(40mg/L)攻击，轻匀，置37℃，50mL/L CO2孵箱中孵育24h，取出离心(800r/min, 10min)沉淀，取上清液0.5mL，用日产全自动生化分析仪检测ALT，AST，BIL，TP值的变化。
2 结果
同一来源培养的离体鼠肝细胞，即使培养时间不同(各自分别培养15，16，17，18，19d)， 但对于同一有效毒性质量浓度的内毒素的反应基本相同. 即均有明显的主要肝损伤指标的异常(图1，2)，但攻击后的肝损伤相关指标的变化与鼠肝细胞培养时间的长短无明显相关性(图1，2)。 提示鼠肝细胞培养至15d左右即可作为有效的毒性靶反应细胞。
图1 内毒素 40mg/L 对鼠肝细胞不同培养时间ALT，AST的影响
图2 内毒素 40mg/L 对鼠肝细胞不同培养时间BIL，ALB，TP的影响
3 讨论
我们采用离体鼠肝细胞培养技术［1-3］，成功地建立了内毒素(E. ColiO111B4)对离体肝细胞的攻击模型. 由于离体肝细胞培养要求较高，培养时间长，寻找一种既肝细胞代谢活跃，且培养时间较为合适的鼠肝细胞实为重要. 我们采用第2代鼠肝细胞，分别培养15，16，17，18，19d，然后用同一毒性质量浓度(40mg/L)的内毒素攻击不同培养天数的鼠肝细胞，测定其相关肝损伤指标，发现各不同培养天数中肝细胞相关指标，AST，ALT的升高及ALB，TP的下降不明显，经统计学处理，发现同一质量浓度内毒素攻击不同培养天数的鼠肝细胞后，其肝损伤指标的变化与培养时间的长短无明显相关性(r=0.05～0.805). 提示实验用离体肝细胞以培养15d左右为佳，它不但代谢活跃，也可缩短培养时间，是相对较为理想的离体攻击模型。
4 参考文献
1 Furukawa K, Mochizuki Y, Sawada N. Properities of peroxisomes and their induction by clofibrate in normal adult rat hepatocytes
in primary culture in vitro. 1994；20：573-584
2 罗树宏，舒衡来，刘多. 鼠肝细胞的培养和传代. 湖南医科大学学报，1991；16：189-192
3 王宇明，丁建，顾长海. 内毒素/肿瘤坏死因子所致肝细胞损害机制的体外研究. 中华传染病学杂志，1996；14：1-3
