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鲎试剂灵敏度的标示值与测定值
2017-07-20 08:46:32
郭建芳 梁国洪 夏振民
《中国药典》1995年版二部附录收载的细菌内毒素试验检查法，在鲎试剂灵敏度复核项下规定，当灵敏度测定值是标示值的二分之一或两倍时(即λc=0.5～2.0λb)，该批鲎试剂方可用于细菌内毒素检查并以λb作为该批鲎试剂的灵敏度。这项规定源于美国药典。1980年美国药典20版开始收入细菌内毒素检查法，但未涉及鲎试剂灵敏度的复核，1985年第21版在该项试验的试验准备项下增加这一要求，开始对内毒素参考标准品(RSE)的稀释浓度未提出要求，只是要求每一浓度需重复4管，对不同浓度的最低凝集点的标准差(S)要求不得大于0.365，如果是8管(S)不得大于0.306，对测得的灵敏度(λc)要求在标示值的0.5～2.0λb，这是最早提出该项指标与要求的官方依据。1990年22版删除了对(S)的要求。1995年版明确给出了内毒素参考标准品的稀释浓度为2λ、λ、0.5λ、0.25λ，λ为鲎试剂标签上标示的灵敏度。
《中国药典》细菌内毒素检查法是在1988年卫生部颁细菌内毒素检查法的基础上又参考1995年版美国药典经修订形成的。1988年的部颁标准主要是参考1985年美国药典制订的，因此在鲎试剂灵敏度测定中，要求对不同浓度的最低凝集点的标准差(S)进行计算，而这一要求一直沿续到目前卫生部《鲎试剂》标准中。1995年《中国药典》细菌内毒素标准品或工作标准品稀释为2λ、λ、0.5λ、0.25λ；(λ为鲎试剂标签上标示的灵敏度)，规定2λ为阳性，0.25λ为阴性，删去S计算，因为在此条件下，计算S失去意义(不可能大于0.365)，所以直接计算λc。只要λc=0.5～2.0λb，该批鲎试剂灵敏度即符合规定，并以标示灵敏度用于产品内毒素检验。这是《中国药典》细菌内毒素检查法规定λc=0.5～2.0λb的经过和依据。
需要讨论的问题是，当鲎试剂的使用者购入试剂后，按规定需要复核试剂灵敏度，如果某批试剂标示灵敏度为0.5EU/ml，复核测定结果为1EU/ml，按规定则判断该批试剂灵敏度合格，可以用于药品内毒素检验，并以标示灵敏度为准。此时，当使用者所要检验药品的内毒素限值应小0.5EU/ml时，检验者担心，因复核灵敏度的测定值(λc=1EU/ml)超过药品内毒素限值(L=0.5EU/ml)，如果检验结果为阴性，是否会出现漏检，导致临床发生不良反应呢?这是一个普遍关心的问题，早在卫生部颁细菌内毒素检查法刚刚执行时，就曾经讨论过这一问题。
细菌内毒素检查法(凝胶法)是一种限度试验，它与热原检查法具有相同的性质，超过某一限度判定供试品不合格，一次检测不可能知道供试品中内毒素量超过多少。低于某一限度判供试品合格。因此，它不像一般化学、物理学测试方法允许误差较小，虽然从1968年鲎试验(Limulus Test)建立后，曾对试管内凝胶形成的性状，主观地分为六档、五档，试图使实验结果精确些，但每档之间仍然是倍倍之差、甚至十倍之差，这种试验允许的实验误差如此之大，令从事理化检验人员难以理解。
问题的关键是，当λc=2λb时，用这种鲎试剂检测的结果是否会出现漏检?笔者认为，对内毒素而言，不可能出现漏检。因为，从理论上，鲎试剂的灵敏度是以致热活性最强的菌株［E.coli O113∶H10∶K(-)］产生的内毒素为国际标准品确定效价而标定的，人工提制的内毒素，其致热活性较天然内毒素的致热性要高出10余倍，而鲎试剂对内毒素的检测，与细菌的种属来源无关，这一点已讨论过。因此，绝大多数情况下，会出现细菌内毒素检查不合格，热原检查合格，临床也不一定出现发热反应。既如此，是否失去了内毒素检查的意义了呢?否，因为在内毒素检查不合格，临床未出现发热反应时，这只是药品生产者的一种侥幸，只能说明样品中污染的内毒素，其致热活性较人工提制的低，如果污染的内毒素致热活性接近人工提制的内毒素，临床就可能发生热原反应，因此内毒素检查不合格品，即使是通过了热原检查，也不可避免出现临床发热反应。这正是目前各国药典纷纷收载细菌内毒素检查法，在很多药品品种检验中以其代替热原检查法的原因之一。
另一方面，当λc=0.5λb时，这种情况容易解释，即检验者会严判自己的制品，如最近报道，因使用福州鲎试剂λb=0.5EU/ml，而λc=0.25EU/ml，使一批氯化钠注射液不合格，改用厦门鲎试剂λb=0.5EU/ml，而λc=0.5EU/ml，该批制品合格。
综上所述，在对样品进行细菌内毒素检查前，复核鲎试剂的灵敏度是必要的，只要鲎试剂符合《中国药典》规定，是不会发生漏检内毒素，临床出现热原反应的。
作者单位：郭建芳、梁国洪：空军后勤部药品检验所 北京 100076；
夏振民：中国药品生物制品检定所
《中国药事》 第13卷 第5期
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