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正确理解细菌内毒素检查法中的“水”
2017-07-19 16:23:01
编者注：细菌内毒素检查法在我国已开展了近二十年，经过许许多多专家学者的努力，目前该行业已经取得了非常重要的成果。但是在实际应用的过程中该领域仍然有许多的问题，这些问题的存在严重阻碍了该行业的进一步发展。
本文作者对这些问题进行了详细的总结，希望他的研究对读者的工作有所帮助！
试验器皿处理不符合要求或被污染导致细菌内毒素试验时阳性不成立呈阴性。许多客户对这种现象不理解，他们认为在细菌内毒素检查过程中，器皿被污染的结果必然导致阴性对照呈阳性，但试验结果恰恰与他们的想象相反。要正确理解这个问题，首先要正确理解鲎试剂与内毒素的反应机理，鲎试剂与内毒素的反应为一系列酶反应，生物酶反应受许多因素的干扰。在日常工作中，我们要特别注意一些因素对试验结果的影响，如PH值、器皿的洁净度以及环境因素等。
这里我们重点谈论“水”对鲎试验结果的影响，这里的水包括：试验器皿洗涤用水和细菌内毒素检查用水。
1 2015年版《中国药典》对水的定义
2015年版《中国药典》通则0261“制药用水”描述“本版药典中所收载的制药用水，因其使用的范围不同而分为饮用水、纯化水、注射用水及灭菌注射用水。
纯化水 为饮用水经蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其他适宜的方法制得的供药用的水。不含任何附加剂，其质量应符合二部纯化水项下的规定。
纯化水可作为配制普通药物制剂用的溶剂或试验用水，不得用于注射剂的配制与稀释。
纯化水有多种制备方法，应严格检测各生产环节，防止微生物污染。用作溶剂、稀释剂或精洗用水，一般应临用前制备。
注射用水 为纯化水经蒸馏所得的水，应符合细菌内毒素试验要求。注射用水必须在防止内毒素产生的设计条件下生产、贮藏及分装。
注射用水可作为配制注射剂用的溶剂或稀释剂及注射用容器的精洗。
灭菌注射用水 为注射用水照注射剂生产工艺制备所得。主要用于注射用灭菌粉末的溶剂或注射液的稀释剂。其质量符合灭菌注射用水项下的规定。”
2 器皿的洗涤用水
2010年版《中国药品检验标准操作规范》310页细菌内毒素检查法“实验准备”规定：“将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液沥干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器中，放置入烤箱中，除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素。”
按照2015年版《中国药典》凡例第二十二条规定“试验用水，除另有规定外，均系指纯化水。”应该特别注意，该规程明确规定最后冲洗玻璃器皿必须“用蒸馏水冲洗。”有的客户使用反渗透制备的纯化水冲洗试验用玻璃器皿，结果试验中所有的阳性对照都为阴性，复核鲎试剂灵敏度时试验结果误差较大，这主要是由于纯化水和蒸馏水的制备方法不同所造成的。由于制备方法不同，反渗透法制备的纯化水中离子浓度高于蒸馏水，而这些阴阳离子经250℃高温干烤不可能被破坏，这些离子对鲎试剂酶反应有较强的抑制作用，造成阳性对照不成立。
常见错误：部分客户使用纯化水冲洗试验用玻璃器皿，更有甚者居然只用自来水冲洗，然后干烤以除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素。这样处理玻璃器皿做细菌内毒素实验的主要现象：阳性对照不成立，灵敏度复核结果也不成立。这是目前所知阳性对照不成立和灵敏度复核结果不成立的主要原因。
解决办法：取一个洁净的盆用蒸馏水冲洗，洗净后盛一盆蒸馏水。将已“用自来水洗净”的玻璃器皿放入盆中，反复冲洗，洗完后更换另盛一盆蒸馏水继续洗，这样更换蒸馏水最少三遍。洗净后放入适宜的密闭金属容器中，放置入烤箱中250℃恒温至少60分钟，除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素。
为了保证试验结果的准确性和检验报告的权威性，我们应该严格遵守操作规程，用蒸馏水冲洗鲎试验用玻璃器皿。
3 细菌内毒素检查用水
细菌内毒素检查用水与灭菌注射用水的区别：酸碱度、细菌内毒素和干扰因素。
3.1 酸碱度 鲎试剂与内毒素反应的最适宜pH在6.5～8.0，故鲎试验时，美国、日本药局方以及中国药典2015版规定检品必须调节PH值6.0～8.0。细菌内毒素检查用水的pH值一般控制在5.0～7.0；灭菌注射用水的pH值应控制在5.0～7.0。由于大部分药品呈弱酸性，故细菌内毒素检查用水的pH值有利于鲎试验。
3.2 细菌内毒素 细菌内毒素检查用水每1ml中含内毒素量至少应小于0.015EU，定量法用细菌内毒素检查用水每1ml中含内毒素量应小于0.005EU；灭菌注射用水每1ml中含内毒素量应小于0.25EU。细菌内毒素检查用水本身的内毒素必须足够低，不应对试验结果产生影响，如果用灭菌注射用水代替检查用水做鲎试验，由于灭菌注射用水中内毒素含量较高，灭菌注射用水和被测样品中内毒素叠加可能产生假阳性，造成企业直接经济损失。因内毒素含量的差别，故不能用灭菌注射用水代替检查用水做鲎试验。
3.3 干扰因素 细菌内毒素检查用水必须对鲎试剂、内毒素标准品和鲎试验不得有干扰；灭菌注射用水对此无要求。灭菌注射用水要求安全稳定，但灭菌注射用水是否会影响细菌内毒素标准品的活性和稳定性？灭菌注射用水是否对鲎试验产生增强或抑制作用？很少有人对此做过长期的考察。经考察验证部分灭菌注射用水对鲎试验存在很强地抑制作用，如果用灭菌注射用水代替检查用水做鲎试验，可能产生假阴性，造成内毒素漏检，直接威胁用药安全。因灭菌注射用水干扰因素的存在，故不能用灭菌注射用水代替检查用水做鲎试验。
如果能保证洗涤用水、洗涤方法和试验用水的准确，鲎试验中阳性对照不成立的可能性基本不存在，除非使用的标准品不规范。为了保证试验结果准确，我们必须做到：
1 熟悉标准及行业规范；
2 使用合格的产品及标准品；
3 严格按操作规程进行操作。
参考文献：
（1）国家药典委员会，中华人民共和国药典（四部）。北京：中国医药科技出版社，2015：通则1143
（2）中国药品生物制品检定所，中国药品检验标准操作规范（2010年版）。北京：中国医药科技出版社，P310。
（3）王思理，胡冠时，汞立青.细菌内毒素检查法及其应用[M].北京：气象出版社，2003:6,10.
（4）莫水晶. ，细菌内毒素检查法与论坛[M].北京：湛江博康海洋生物有限公司，2007:6（1）
（5）莫水晶. ，细菌内毒素检查法与论坛[M].北京：湛江博康海洋生物有限公司，2006:5（1）
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