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应用研究
细菌内毒素研究与检测的临床应用
Date: 2018-09-18 15:38:17
李秀琴（综述） 刘津（审校）
（海洋石油总医院检验科，天津300452）
摘要：长期以来，众多学者对细菌内毒素进行了大量的研究，取得了一些成果，发表了大量的论著。现已证明细菌内毒素就是革兰氏阴性细菌细胞壁的脂多糖成分，具有广泛的生物活性。微量的内毒素进入机体，将会出现发热、血压降低、弥散性血管内凝血、内毒素败血症等一些列临床反应。内毒素检测对鉴别诊断革兰氏阴性杆菌感染具有重要的参考价值，有助于早期判断感染类型及是否存在内毒素败血症，有利于指导临床用药及判断预后。关键词：内毒素；革兰氏阴性菌；内毒素败血症
内毒素是严重威胁人类健康的致病因子，很少剂量的内毒素即能引起极广泛的生物及病理作用，因而加强内毒素的检测研究便成为临床、公卫及药检领域的重要课题。随着检测方法的研究发展，各种分析技术的交融，更多细菌内毒素检测方法应运而生。对于内毒素的研究，正向着细胞和分子水平层面发展，我国对这方面的研究尚处于初级阶段。随着对内毒素结构、功能与作用机制认识及检测方法研究的不断深入，人类一定能攻克内毒素感染及相关疾病的临床难题。
1 细菌内毒素的发现
细菌内毒素这个概念在1890年就已被提出，它是在研究发热物质过程中所引起的，1933年由Boivin最先从小鼠伤寒杆菌中提取出来，进行化学免疫学方面的研究。1940年，Morgan使用志贺菌阐明了细菌内毒素是由多糖、脂质及蛋白质三部分组成的复合体。1950年以后，随着生物学、物理化学、免疫学以及遗传学等的进步发展，细菌内毒素的研究工作，尤其是其化学机构组成及各种生物活动间的关系也更加明确起来。
2 细菌内毒素的概念
细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上特有结构，细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或黏附在其他细胞时才表现其毒性，内毒素为外源性致热源，它可激活中性粒细胞等使之释放出一种内源性热源质，作用于体温调节中枢引起发热。内毒素的主要化学成分为脂多糖中的类脂A。
3 细菌内毒素在人体引起的症状
3.1 发热反应 人体对细菌内毒素极为敏感，极微量（1～5ng/kg）内毒素就能引起体温上升，发热反应持续约4h后逐渐消退。自然感染时，因革兰阴性菌不断生长繁殖，同时伴有陆续死亡，释放内毒素，故发热反应将持续至体内病原菌完全消灭为止。内毒素引起发热的原因是内毒素作用于体内的巨噬细胞等使之产生白细胞介素1、6和肿瘤坏死因子α等细胞因子，这些细胞因子作用于宿主下丘脑的体温调节中枢，促使体温升高发热。
3.2 白细胞反应 细菌内毒素进入宿主体内以后，血流中占白细胞总数60%～70%的中性粒细胞数量迅速减少，这是因为细胞移动并黏附到组织毛细血管上了。但1～2h后，内毒素诱生的中性粒细胞释放因子刺激骨髓释放其中的中性粒细胞进入血流，使其数量显著增加，有部分不成熟的中性粒细胞也被释放出来。由于绝大多数被革兰阴性菌感染的患者血流中白细胞总数都会增加，所以医师在诊断前为了初步区别是细菌性感染还是病毒性感染，常常要化验患者的血液，对白细胞进行总数和分类计数。
3.3 糖代谢紊乱 在急性内毒素早期先发生高血糖，转而为低血糖。发生高血糖机制尚不明确，可能与应激反应和糖异生增强有关，从分子水平看，糖异生是内毒素血症早期能量的重要来源，因为内毒素血症导致微循环障碍，细胞缺血缺氧，有氧代谢减弱，无氧代谢增强，机体对葡萄糖的需求增加，糖异生增加。大量糖原消耗，可能与肾上腺素大量分泌有关。
3.4 血管舒缩机制紊乱 内毒素激活了血管活性物质（5-羟色胺、激肽释放酶与激肽）的释放。末梢血管扩张，通透性增高，静脉回流减少，心排血量减低，并可发生休克。因重要器官(肾、心、肝、肺与脑) 供血不足而缺氧，有机酸积聚而导致代谢性酸中毒。
3.5 其他症状 内毒素还能引起早期粒细胞减少症，以后继发粒细胞增多症，活化补体C3，引起由补体介导的各种反应等。
4 检测方法
4.1 家兔检测热原法 1942年，美国药典首先将家兔热原检查项收入药典成为法定方法，中国药典1953年版开始收藏该方法，随后世界各国药典都以动物热原法作为药品质量监测的方法之一。这种化验程序是探测内毒素的高热活性（发热诱导）。在实验兔子的直肠插有温度计，且兔子感染了含内毒素的实验溶液（提取内毒素的实验固体物必须用无热质消过毒的溶液冲洗）。3h后兔子的直肠检验出发热的迹象。兔子尝试实验（也叫热原试验）检测到内毒素的最小浓度为0.1ng/ml。
4.2 鲎试验法 1968年，Levin和Bang发现阿米巴样血细胞含有一种物质，当和极小量的内毒素混合时就变成胶质，这个发现逐渐发展就形成了现在的实验方法鲎变形细胞溶解产物实验。鲎实验法比以往检测内毒素的方法更便利敏捷，灵敏度高，能检测出最少300个细菌释放的内毒素。在药学、微生物学及临床检验等领域应用较为广泛。1980年，美国药典首先收载此法，1995年，中国药典收载了修订后的细菌内毒素检查法，取消了原热原检查。2003年，对细菌内毒素定量检测开始在我国临床全面开展应用。
4.3 鲎试验替代方法的研究 细菌内毒素测定除鲎试验法外，还有罗氏蛋白染色法、荧光偏振法、碘同位素标记法、酶联免疫测定法等。应用较多的是酶联免疫测定法，它是基于抗原抗体酶联免疫测定法，由外加热原质刺激巨噬细胞产生的内热原（如肿瘤坏死因子、白细胞介素1等）而进行测定的方法。
鲎是一种珍稀动物，鲎资源的保护越来越受到重视，对于它的替代方法研究也越来越深入。在日本已经生产出从蚕的体液中提取酶制备的蚕试剂，美国也已在通过基因重组的方法复制鲎试剂酶因子方面获得了突破。我国现在也应加快开展这方面的研究。
5 内毒素检测的临床应用
5.1 肝炎 肝炎患者常并发内毒素血症。甲型肝炎的内毒素血症发生率为58%，其发病率和内毒素水平均随着病程的延长而下降，两者与病程均有非常显著的意义。乙型肝炎的内毒素血症发生率与病理类型有关。有文献报道急性病毒性乙型肝炎发病率占59%，随着病情的缓解内毒素水平逐渐下降。慢性活动性乙型肝炎时出现内毒素血症占53. 7%，并且有80%的患者持续存在内毒素血症。丙型肝炎中的慢性活动性肝炎内毒素血症发病率高，但血清丙氨酸转氨酶水平与内毒素血症发生率及含量无明显关系。内毒素的水平与病毒性肝炎的病情程度有很大关系。检测血浆内毒素水平对判断病情轻重和预后有一定的临床意义，也为抗内毒素治疗作为病毒性肝炎的辅助治疗提供了理论基础。
5.2 肝硬化 肝硬化并发内毒素血症十分常见。正常情况下内毒素主要被肝脏的库普弗细胞所清除。肝硬变后，由于库普弗细胞清除能力下降或由于肝内组织结构和血流的改变，使内毒素不能与库普弗细胞充分接触，门脉高压侧支循环开放，也使内毒素不能在肝内清除或绕过肝脏而进入体循环。肝硬化患者机体免疫功能下降，调理素、IgM等不足或功能减弱，使进入体循环的内毒素不易及时清除，造成严重的内毒素血症。肝脏可提取血流中内毒素的80%～90%，故血中内毒素的升高反过来加重了对肝功能和结构损伤。故肝硬变时高内毒素水平可造成肝功能的进一步损害。
5.3 胆管疾病 正常情况下来自胆汁的胆酸、胆盐及分泌型IgA等能抑制肠内菌群的过度繁殖和内毒素的产生。维持黏膜屏障的完整，阻止内毒素的吸收。梗阻性黄疸时，单核巨噬细胞系统尤其是肝脏库普弗细胞功能受抑，肠道内胆汁缺失使内毒素增大，致内毒素血症发生率增高。内毒素浓度与梗阻性黄疸的程度（血清胆红素）以及持续时间有一定关系，与术后并发症发生率也密切相关。因此，术前检测内毒素对预测术后病情有一定价值。
5.4 急性胰腺炎 有文献报道，急性胰腺炎的轻重程度与血浆内毒素水平呈正相关。急性胰腺炎时，患者伴有不同程度的肠道运动抑制，可致肠道内细菌生长，有害菌数量增加，细菌和内毒素可从肠道源源不断进入体循环和远隔器官，导致内毒素血症和多器官功能衰竭。内毒素还可以诱导巨噬细胞大量分泌肿瘤坏死因子，肿瘤坏死因子是内毒素介导的休克和组织损伤的关键介质。急性胰腺炎并发内毒素血症较为常见，约占66%。值得注意的是死亡病例生前均并发内毒素血症且持续存在直至死亡。因此，急性胰腺炎早期测定血浆内内毒素有助于判断疾病的严重程度，指导治疗。
5.5 原因不明的发热 内毒素是一个强力的热原物质，每毫升血液中达皮克级的内毒素就能使人发热。免疫低下儿童在诊断和治疗上一直存在问题。有文献报道对一些检查不出菌血症和临床感染的发热的免疫低下儿童作了内毒素检查，其结果是所有发热儿童在发热期间内毒素水平均高于正常儿童水平，发热恢复后内毒素含量都降至正常水平。这与Schultz等对成年人进行的类似研究的结果一致。因此，内毒素血症可能是免疫低下患者原因不明发热的因素之一。因而血浆内毒素检测可以发现隐蔽的易被忽略的感染。
6 小结
许多研究表明，内毒素与许多感染疾病密切相关，内毒素血症多随病情恶化而加重，随病情缓解而减轻。因此，快速定量检测各种样品中的内毒素浓度，对于临床内毒素血症早期诊断、合理用药及药品检测具有重要价值。并作为一个衡量病情和判断预后的参考指标，也可用于指导临床治疗，判断疗效和筛选恰当的药物。
《医学综述》2012年2月第18卷第4期
