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凝胶法细菌内毒素检查中常遇的问题及解决方法
Date: 2017-07-20 09:34:13
陈邦树 广西壮族自治区药品检验所 广西南宁 530021
[摘要] 目的： 探讨 凝胶法细菌内毒素检查中常遇的问题及解决方法。 方法： 对实际工作中遇到的一些具体问题进行多侧面的分析。 结果： 对凝胶法细菌内毒素检查中常遇的问题 进行分析并提出了解决方法。 结论： 凝胶法细菌内毒素 检查法影响因素较多，存在的问题仍需多方努力进行克服。
[关键词] 凝胶法 环境内毒素 鲎试剂 问题
细菌内毒素检查法的优越性已为大多数质检人员所体会和认识。但在实际工作中，也有一些问题使实验者感到困惑。因此，作者认为有必要对这些问题提出并加以探讨，供大家参考。
1. 选择鲎试剂（TAL）的灵敏度值等于样品原液细菌内毒素限值进行试验是最佳方案吗？
未必！选择TAL的灵敏度值等于样品原液细菌内毒素限值进行试验，无疑可节省对样品的稀释，但却不利于减少样品溶液对细菌内毒素试验干扰的可能性。中国药典从1998年增补本开始的细菌内毒素检查法已增加了供试品阳性对照（PPC）管，如因样品溶液浓度较高而出现PPC管不凝的情况，会导致试验无效，结果“最佳方案”可能变成重试方案。如今，国内TAL的制备技术得到了较大的发展，更高灵敏度（0.25 EU/ml、0.125 EU/ml、0.06 EU/ml、0.03 EU/ml）的TAL供应已不成问题。为减少样品溶液对细菌内毒素试验的干扰和避免上述重试情况的产生，不如开始就选择更灵敏的TAL并对样品原液作MVD稀释后进行试验。
2. 阳性管（PC管）不凝，为什么？
原因无非3个方面。⑴、试剂问题〔包括内毒素和TAL〕。⑵、实验条件问题。⑶、操作问题。
近年，国产TAL活性较稳定，其稳定性可达室温保存2-3 年；细菌内毒素亦具有耐热性，通常在其有效期内常温保存或运输其活性不受影响。唯需注意的是，使用小装量的试剂（包括内毒素和TAL）较使用大装量的试剂容易导致PC管不凝的情况发生。这是由于小装量的试剂较之大装量的试剂更不易控制支间差异所致。尽管如此，我们仍有理由相信在大多数情况下试剂不是造成PC管不凝的主要原因。如我们自1995年使用旋涡混合器以来，在本所实验室条件下，细菌内毒素试验尚未见到PC管不凝的情况。个别单位发现PC管不凝后，把TAL及内毒素拿到本实验室再进行试验，结果PC管凝得很好。但是，当我们自备试剂到外单位抽检并就地进行细菌内毒素试验时，却在2个实验室发现过PC管不凝的情况。究其原因，认为保温环节出问题的可能性最大。一次是保温过程中水浴箱电源插座接触不良，恒温不能保证，实验结束时发现水浴温度已由原来的37.2℃变成了36.0℃；另一次是某单位使用无盖式恒温水浴锅代替有盖式电热恒温水浴箱，水表层的温度可能并未达到37℃。由于TAL的成胶时间与温度在一定的范围内呈负相关。温度偏低将使成胶时间延长。这样，在规定的时间里PC管不凝也就不足为奇了。造成水浴温度实际偏低的另一原因，还可能是因为实验者把温度计放在发热管附近监测反应温度所致。我们主张采用电热恒温水浴箱上的水银温度计监测反应温度。精确的控温是试验取得准确结果的重要保证。此外，操作上我们还应注意内毒素的溶解稀释过程要按药典的规定进行（振荡的时间及强度要保证），以使内毒素的磷脂A部分（毒力活性部位，也是与TAL结合的部位）能通过激烈振荡充分暴露。
3. 同一批检品进行多次细菌内毒素检查时，有时判为合格有时判为不合格，为什么？怎么办？
假如操作和实验条件均可信赖（符合药典要求）的话，那么上述问题大体可表述为3种情况：1、同一批检品用同一厂家的TAL（灵敏度相同或不同）检查结果不同。2、同一批检品用不同厂家的TAL（灵敏度相同或不同）检查结果不同。3、同一批检品但不同瓶用同一厂家的同一批TAL检查结果不同。
我们知道，药典规定 TAL的灵敏度实测值即使是其标示值的 50% - 200%仍认为是合格的TAL，实验时应以其标示的灵敏度为准。正是这个原因便足以导致上述前两种情况的产生而不一定是不同厂家的原因。例如：有2批TAL（厂家相同或不同）的标示灵敏度均为0.25 EU.ml -1 ，由同一人使用同一支细菌内毒素国家标准品同时复核灵敏度，实测值分别为0.5 EU.ml -1 （为标示值的200%）和0.125 EU.ml -1 （为标示值的50%），结果均应判为合格。实验时其灵敏度均应按标示灵敏度0.25 EU.ml -1 执行。假如有一批注射用水的细菌内毒素污染量真值为0.2 EU.ml -1 （合格品），那么不难看出，用灵敏度实测值为0.5 EU.ml -1 的TAL检查结果可能合格，而用灵敏度实测值为0.125 EU.ml -1 的TAL检查结果则可能不合格。这种情况的存在是药典所允许的，也是安全的。实验者在遇到这种情况时，应警惕这种检品已属“边缘产品”，判为不合格只会使你免冒临床热原反应的风险。
第二种情况的产生，还有 2种可能性。其一，可能是由于不同厂家生产的鲎试剂对细菌内毒素的特异性不同所引起。当供试品中含有某种非内毒素的G因子激活物时，如用某厂生产的特异性较高的鲎试剂检查，可能会得到合格的结论，而用另厂生产的普通鲎试剂检查，则可能会得到不合格的结论。我们在研究“精制脑组织注射液” [2] 细菌内毒素检查法的实验中观察到，样品在多种浓度下对某厂生产的鲎试剂反应为阴性，而相同浓度的样品对另一厂家生产的相同灵敏度鲎试剂反应则为阳性。对于这种“不合格”可能就是由于G因子被非内毒素物质激活所致，是细菌内毒素检查的假阳性反应（临床无热原反应）。采用特异性鲎试剂进行细菌内毒素检查便可避免假阳性结果的产生。其二，是由于两个厂家的TAL对于精制内毒素的反应特性相同而对于环境内毒素的反应则差异过大所致，内毒素检查阴性者往往是一种假阴性反应（家兔出现发烧或临床发生热原反应），是对热原反应的漏检。这种现象报道的极少，但不是没有。我们在对一批明显发生家兔热原反应的“清开灵注射液”进行内毒素检查时发现，对“精制内毒素”具有相同灵敏度的两个厂家的鲎试剂，其对该批清开灵注射液的内毒素检出却存在很大的差异（将另文报道）。对此问题，解决的办法有三：1、统一鲎试剂的配方和生产工艺；2、研制出“环境内毒素”国家标准品及工作标准品，然后在鲎试剂质量标准中增加对环境内毒素灵敏度的考查内容；3、找寻并深入研究不用TAL，但更能代表人体发热的热原质检测新方法。
第三种情况，同一批检品但不同瓶用同一厂家的同一批 TAL检查结果不同。这种情况我们在大输液的细菌内毒素检查中实际遇到过 [3] ，而且即使换人及换TAL进行检查这种不同的结果仍可重复。排除操作对样品污染的可能后对样品进行细菌内毒素污染量测定，发现两瓶大输液之间的细菌内毒素污染量相差4倍以上。可见细菌内毒素污染的瓶间差异是造成第三种情况的原因。这一现象也提示我们，在发生临床热原反应而怀疑药品原因时，送检作细菌内毒素检查的样品首先应当是病人未输注完的药液，其次才是同一批号的未开封样品，此可避免热原反应的漏检。
此外，TAL的支间差异当然也会导致上述3种情况的发生，但TAL的支间差异所造成的多次实验结论的不同，其最大的特点是偶然性和不可重复性，这与上面所讨论的情况很易区别。
4. 相同品种的注射剂可否采用他人建立的细菌内毒素检查法？
一般情况下是可以的，但决定采用他人建立的细菌内毒素检查法前必须三思。因为一个新品种是否适合作细菌内毒素检查，关键是要证明你的供试品对你所使用的TAL是否有干扰，以及干扰能否被消除。然而，你的供试品与他人的供试品如果生产工艺不同，就有可能含有不同程度或不同类别的干扰物质，干扰的程度甚至消除干扰的方法都可能不同。同理，别人作干扰试验用的TAL 生产厂家可能与你进行内毒素检查时所用的TAL生产厂家也不同，由于TAL在生产工艺上各厂家也有所不同，会造成TAL的组成成分有所差异，也会导致干扰性的不同。因此，中国药典2000年版的细菌内毒素检查法中规定：“当鲎试剂、供试品的来源、供试品的配方或生产工艺有变化时，须重新进行干扰试验”。此外，在参照别人的研究方法时还应注意该品种的细菌内毒素限值设置是否安全合理，否则应重新设置。
5. 中国药典是最高药品标准吗？
是，也不是！从法律角度去理解它是我们国家的最高药品标准；从技术角度去理解它却是最基本的标准。清醒地认识这一点，细菌内毒素检查法代替热原检查法才能做得更多、更快和更好。
首先，从检验方法的先进性看，世界各国的药典只是最基本的标准。在日本，药品生产企业的质检人员在进行药局方品种的药品质量检验时并不一定按日本药局方规定的方法进行，而可能用更先进的方法进行检验，目的就是为了更好地控制药品质量。美国药典已有超过600种注射剂放弃热原检查而用更灵敏的细菌内毒素检查，中国药典2000年版只有67种。面对如此大的差距，我们的药品生产企业还有什么理由不敢越雷池一步呢？中国药典二部凡例中载道“本版药典收载的原料药及制剂，均应按规定的方法进行检验；如采用其他方法检验，应将该方法与规定的方法做对比试验，根据试验结果掌握使用，但在仲裁时仍以本版药典规定的方法为准。”可见，药典对于药品生产企业使用细菌内毒素检查法（包括凝胶法和定量法）代替热原检查法是开着绿灯的。
其次，从药品质量把关的严格程度来看，世界各国的药典也只是药品必须达到的最低质量要求。在欧洲，药品生产企业通常将自己注射剂的细菌内毒素限值控制在欧洲药典规定限值的1/2 ～1/3；在美国，药品生产企业通常也将自己注射剂的细菌内毒素限值控制在美国药典规定限值的1/5 ～ 1/10。由此可见，药典规定的细菌内毒素限值是注射剂起码要达到的要求，而不是最高的要求。
6. 什么药品品种需要做细菌内毒素检查？
虽然“热原”不完全等于“细菌内毒素”，但“细菌内毒素”必定是“热原”。因此，什么品种需要控制热原，什么品种就需要做细菌内毒素检查。就药品而言，所有通过注射途径（包括动、静脉，皮内、皮下，肌内，腔内等）进入机体内的药品都在此范围。以前小针剂在制订质量标准时是不设热原检查项的，原因是认为注射体积太小，不会引起热原反应，其实这种认识不够全面。热原反应的发生与否不在于注射体积的大小而在于单位时间内细菌内毒素注射进入肌体的量的多少。这是小针剂要进行细菌内毒素检查的第一理由。其次，由于临床上常有多种注射药物联合使用的情况，细菌内毒素的累加作用显而易见，这又增加了热原反应的危险。因此，有必要对每一种注射剂进行细菌内毒素检查。
7. 进行细菌内毒素检查前必须具备的条件是什么？
⑴、实验所用器具“无细菌内毒素”。⑵、鲎试剂灵敏度的确证。⑶、无干扰因素。这3条也是检验细菌内毒素试验是否有效的重要标准。
8. 干扰试验是否要选择合适的样品或合适的TAL灵敏度？
是的。具备一定条件的样品才适合做干扰试验，而样品是否合适，在一定程度上又与所选 TAL的灵敏度密切相关。所谓“合适”的样品是指样品必须不含有可测出的细菌内毒素。具体的讲就是在干扰试验（或干扰试验的预试验）中用样品（或样品的稀释液）所做的阴性管（NPC管）不能凝，如凝说明本批样品不适合用来做干扰试验。有部分实验者认为只要用家兔热原检查结果阴性的样品就可用于干扰试验。这不可靠，因为家兔法不如细菌内毒素检查法灵敏，不能保证在干扰试验（或干扰试验的预试验）中样品的细菌内毒素不被检出。所谓“合适”的TAL灵敏度，是指做干扰试验时所选的TAL灵敏度不能太灵敏，以免得出样品不适合做干扰试验的结论，这是一个实验技巧的问题。另有些实验者认为在正式做干扰试验时，选择TAL的灵敏度（λ）值必须与样品的稀释倍数（D）有一定的对应关系（如按公式λ = L/D），这是误解。其实，除了要考虑使样品的细菌内毒素不被检出外，别无理由规定要选什么样的TAL灵敏度去做干扰试验。
9. 干扰试验中内毒素回收试验是否都必须做？
不一定。回收试验的目的是为了考察消除干扰的方法是否会造成样品中原有内毒素检出的增加或减少。因此，对于采用“过滤法”、“沉淀法”、“酸碱调节法”及其他有可能造成样品中原有内毒素检出的增加或减少的方法，理应做内毒素回收试验；而对于直接采用细菌内毒素检查用水稀释就可消除干扰者，则无须进行内毒素回收试验。因为细菌内毒素检查用水含内毒素的量极微，不会对样品中原有内毒素的检出造成明显影响。可见，采用细菌内毒素检查用水稀释消除干扰者，无须进行内毒素回收试验。
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