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应用研究
海浪牌动态浊度法鲎试剂的使用特点说明
Date: 2017-07-19 15:53:41
湛江博康海洋生物有限公司质量管理部推荐
一、概述定量法鲎试验，快速、简单、经济、结果准确、定量范围广，是目前世界医药卫生领域开展的一项专一的细菌内毒素检查方法。
定量法鲎试验的特点：
1、通过反应曲线，直观显示鲎试剂的反应过程，可以鉴别是内毒素反应还是非内毒素假阳性反应；
2、快速、准确检测样品中的内毒素含量，有利于药品生产过程中的质量控制；
3、可以检测临床病人体液中的内毒素含量，作为疾病诊断的依据；
4、操作简单、可靠性高；
5、仪器波长660nm。
二、鲎试剂
定量法鲎试剂不同于凝胶法鲎试剂，它对鲎血细胞提取物的纯度、溶解度、澄明度以及对内毒素反应的线性关系都有较高要求。
质量重点考察指标：
1、无菌；
2、细菌内毒素；
3、最低检测限；
4、支间差异；
5、标准曲线的有效性考察；
6、稳定性考察。
三、复溶与分装
鲎试剂在复溶前，须轻弹试剂瓶使瓶壁上的试剂粉末落到瓶底（注：残留在试剂瓶盖或瓶壁上的微量粉末可忽略不计），小心打开试剂瓶盖或折断曲颈部，避免接触污染。使用前按标示量加入检查用水复溶试剂，可将定量鲎试剂在旋涡混合器上点触2-3秒促进定量鲎试剂的充分溶解，将复溶好的定量鲎试剂全部取入同一试管（或安瓿）混合均匀后，分装到定量分析专用试管中，一般每管分装0.1ml。
四、标准曲线的有效性考察
取细菌内毒素国家标准品1支，按规定制成至少3个等比系列稀释液（建议选用4个等比系列稀释液，稀释度建议选用4），为λ1、λ2、λ3和λ4，每一浓度平行做3支。另做2支阴性对照，当试验结束，阴性对照结果OD值不超过仪器及试剂推荐值（如0.02）时，将全部数据进行回归分析。
1、直线LgT=a+bLgC的相关系数|r|≥0.9800，建议选用|r|≥0.99，标准曲线更精确（见左下图）。
2、等比系列稀释液中不同浓度的内毒素的反应曲线应有明显区别，其中内毒素浓度越高，动力学曲线越陡峭，曲线位于坐标左侧；内毒素浓度越低，动力学曲线越平缓，曲线位于坐标右侧，从左到右时间间隔应逐步递增（见左上图）。
3、每个点应做3支平行管，平行管的变异系数（CV%）应不大于10%，建议选用5%的标准。变异系数主要由三个因素引起：仪器、试剂和操作。
六、最大有效稀释
中国药典2015年版规定头孢曲松钠（规格：2mg/支）的内毒素限值是0.20EU/mg（P253页）。最大有效稀释倍数（MVD），按照中国药典2015年版提供的公式来计算：
3、每个点应做3支平行管，平行管的变异系数（CV%）应不大于10%，建议选用5%的标准。变异系数主要由三个因素引起：仪器、试剂和操作。
六、最大有效稀释
中国药典2015年版规定头孢曲松钠（规格：2mg/支）的内毒素限值是0.20EU/mg（P253页）。最大有效稀释倍数（MVD），按照中国药典2015年版提供的公式来计算：
MVD＝CL/λ
λ在光度测定法中为所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。
如，湛江博康海洋生物有限公司定量法鲎试剂（批号：1612101）最低检测限为0.015EU/ml时，制做标准曲线的最低内毒素浓度为0.0312EU/ml。其方法是先用5ml检查用水溶解头孢曲松钠制得C＝2.0mg/5ml＝0.4mg/ml；其中 L=0.20EU/mg，λ=0.0312EU/ml，计算：
MVD＝CL/λ
＝0.4×0.20 /0.0312
＝2.56倍
七、定量检查法
按2015年版《中国药典》通则1143细菌内毒素检查法“光度测定法的干扰试验”中的操作步骤进行检测。
试验必须符合以下四个条件方为有效：
1、当使用储存的标准曲线时，必须选择等于或接近标准曲线中点的内毒素浓度作为阳性对照，并且阳性对照误差必须在±25%以内；
2、反应曲线必须满足内毒素反应曲线的特征：反应曲线呈S型、速度曲线大约为正态分布。
3、做回收率试验时，样品阳性对照管应含有等于或接近标准曲线中点的内毒素浓度，若标准曲线的内毒素浓度点为等比系列其第二个浓度即为中点浓度，如：2.0EU/ml、0.5EU/ml、0.125EU/ml和0.03EU/ml，则0.5EU/ml即为中点浓度。内毒素的回收率要在50%～200%的范围内，最好控制在80%～150%。如阳性对照的检测值与加入值差别较大时，建议以绝对回收率判断试验的有效性。
4、阴性对照的反应时间应大于标准曲线最低浓度的反应时间。
若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，判供试品符合规定。若大于或等于规定的内毒素限值，判供试品不符合规定。
分析讨论：
1、通过分析反应曲线，内毒素呈S型特征曲线（动态浊度法鲎试剂质量标准(草案)），部分样品（葡萄糖注射液、Vc注射液、塑瓶装葡萄糖注射液、血制品、抗凝血酶和血液透析器等）可能呈非内毒素反应，检测数据无效。（见下图）
如，湛江博康海洋生物有限公司定量法鲎试剂（批号：1612101）最低检测限为0.015EU/ml时，制做标准曲线的最低内毒素浓度为0.0312EU/ml。其方法是先用5ml检查用水溶解头孢曲松钠制得C＝2.0mg/5ml＝0.4mg/ml；其中 L=0.20EU/mg，λ=0.0312EU/ml，计算：
MVD＝CL/λ
＝0.4×0.20 /0.0312
＝2.56倍
七、定量检查法
按2015年版《中国药典》通则1143细菌内毒素检查法“光度测定法的干扰试验”中的操作步骤进行检测。
试验必须符合以下四个条件方为有效：
1、当使用储存的标准曲线时，必须选择等于或接近标准曲线中点的内毒素浓度作为阳性对照，并且阳性对照误差必须在±25%以内；
2、反应曲线必须满足内毒素反应曲线的特征：反应曲线呈S型、速度曲线大约为正态分布。
3、做回收率试验时，样品阳性对照管应含有等于或接近标准曲线中点的内毒素浓度，若标准曲线的内毒素浓度点为等比系列其第二个浓度即为中点浓度，如：2.0EU/ml、0.5EU/ml、0.125EU/ml和0.03EU/ml，则0.5EU/ml即为中点浓度。内毒素的回收率要在50%～200%的范围内，最好控制在80%～150%。如阳性对照的检测值与加入值差别较大时，建议以绝对回收率判断试验的有效性。
4、阴性对照的反应时间应大于标准曲线最低浓度的反应时间。
若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，判供试品符合规定。若大于或等于规定的内毒素限值，判供试品不符合规定。
分析讨论：
1、通过分析反应曲线，内毒素呈S型特征曲线（动态浊度法鲎试剂质量标准(草案)），部分样品（葡萄糖注射液、Vc注射液、塑瓶装葡萄糖注射液、血制品、抗凝血酶和血液透析器等）可能呈非内毒素反应，检测数据无效。（见下图）
2、内毒素反应速度大约为正态分布，先快后慢，最后停止反应，反应过程中有反应速度最高峰，如分析该反应过程发现反应速度与内毒素不符，可以判断该反应为非内毒素反应，检验数据无效。（见下图）
3、本使用方法仅适用于湛江博康海洋生物有限公司生产的海浪牌动态浊度法鲎试剂。
【注意事项】
1、 本试验用具要求无菌无热原，建议使用本公司提供的吸嘴、试管等试验耗材。
2、 试验结束，未获得反应数据按0计算。
3、 制做标准曲线时，必须用中检所提供的细菌内毒素标准品。
4、 细菌内毒素标准品必须用砂轮在瓶颈上部划痕开启，并用酒精棉球消毒。
5、 仪器波长660nm。
【注意事项】
1、 本试验用具要求无菌无热原，建议使用本公司提供的吸嘴、试管等试验耗材。
2、 试验结束，未获得反应数据按0计算。
3、 制做标准曲线时，必须用中检所提供的细菌内毒素标准品。
4、 细菌内毒素标准品必须用砂轮在瓶颈上部划痕开启，并用酒精棉球消毒。
5、 仪器波长660nm。
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