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应用研究
鲎法测定细菌内毒素影响因素的研究进展
Date: 2017-07-18 16:46:59
鲎试剂法是利用鲎血细胞溶解物与微量（pg/ml级）细菌(主要是革兰氏阴性细菌,G-)的内毒素反应,从而检出被检物中内毒素的一种生物体外检测新技术。因为其具有快速、简便、经济、灵敏度高、重现性好、一次可同时测几个样品等优点，自从一九六四年美国学者Levin 和 Bang发现此法以来[1]，鲎法正被日益广泛地应用于医药卫生、食品卫生、环境卫生、分子生物学、以及微生物学中。
鲎法大致可分为凝胶法、比浊法色原基质法、以及免疫法等。本文依据文献报道，总结了近年来国内外学者在用这些方法测定细菌内毒素时发现的一些影响因素及其消除方法的研究进展，以供试验者参考。
1 试验条件与操作
培养条件、操作环境可能引起各次实验之间、各实验室之间的结果差异[2]。
1.1 时间
鲎试剂在液态时极不稳定, 室温放置太久会影响反应灵敏度，故加样结束后,应立即放入恒温水浴中。 [3]延长保温时间，可提高LAL的灵敏度。[4]
有研究者[5]发现细菌内毒素国家标准品和工作标准品的不同混合时间与相对活性之间具有一定的规律，即５分钟时混合点的活性最强，混合时间越长，活性反而降低，但在三十分钟以内的各混合点测定的灵敏度均在规定范围之内。
在显色法中灵敏度与时间有关，故实验过程中既要严格控制每个环节的保温时间，又要严格控制终止时间[2][6][7]。
1.2 温度
凝胶试验规定的孵化温度为37℃。但在夏季高温季节，如果同时作几个样，阳性对照不成立的现象时有发生，故应改为冰浴。[3]
郭录平[4]通过实验证明，保温在25-41℃内，随着温度的升高，LAL的灵敏度也随着升高；在41-46℃之间，对灵敏度无明显影响；≥48℃会破坏鲎试剂。
另外在显色法中的灵敏度也与控制温度有关[6][7]。
1.3 pH值
高国政等人[8]用动态浊度法详细研究了样品pH 值对细菌内毒素测定的影响，结果发现：样品 pH 在6-8间实验结果稳定；pH ≤3 或≥12时，实验受到抑制，平均回收率≤56.8%。最后得出结论：使用TAL 时，供试品 pH 应预调在6.5-7.5 为好；使用 LAL 时，pH 应预调在6.2±0.1或 6.7-7.8为好。
也有人认为[4][7][9] 鲎试验的 pH 应为6.5-8.5，以7.0-7.5为佳。必要时可用无内毒素的 HCl 或NaOH 调节 pH 值[2]。
1.4 试验器具
内毒素稀释不宜用注射器，而应用经过校正的刻度吸管。因为注射器刻度不准，而且,针栓壁磨沙面易吸附内毒素而使其浓度不够,造成凝胶反应不成立[3][10]。
普通玻璃及塑料管也会影响实验结果[2][9]，用硬的玻璃管及AR玻璃管较为合适。一般硼酸玻璃管测得的效价较低,而且LAL的灵敏度愈低，管对测定的结果影
响愈大。操作中常用的聚丙烯塑料管可能干扰结果。
1.5 操作程序
有实验者发现[3][11]：操作次序也影响试验结果。应该先吸取供试品、然后加入阴性对照及阳性对照液，最后按供试品管、阳性对照管、阴性对照的顺序逐一精确加入鲎试剂。未按此程序容易出现阳性反应不成立的现象。
1.6 处理作用
Pedersen MR和Hansen EW[12] 将内毒素溶液用玻璃试管干燥，在氧丙环（Ethylene Oxide，EO）450或900mg/l中暴露1-46小时后，内毒素的LAL活性减少至百分之三十。将多粘菌素B（Polymyxin B，PB）加入到内毒素稀释液中会减少其活性百分之七十五。内毒素经过EO处理会减少LAL活性百分之七十，进一步加入PB会减少LAL的活性百分之九十九。EO对内毒素的反应会减少其LAL活性，也会减少其热源反应，增加与PB的亲和性。
Bamba T[13] 等学者研究了平滑型G-细菌的内毒素（Smooth gram-negative bacteria ，S-form)经过高温蒸气处理后的灭活效果，观察到不同种细菌的抗热性显著地不同，减弱率与浓度有关。低浓度（10ng/ml）内毒素处理后的活性可降低至可测定的限度下。粗糙型（Rough strains，R-form) 细菌的内毒素减弱时间曲线与个别平滑型相似。平滑型，尤其是Rc突变体（Rc mutant）细菌的内毒素灭活性能够被Mg2+，Ca2+等二价阳离子显著影响。
FDA认为不同的产品处理和储存条件可能会引起对某一样品试验的分析误差。Guilfoyle DE [14]等人通过实验发现培养细菌的培养基以及溶剂的储藏温度均不会引起任何问题。然而，因为溶液在瓶中没有充分震荡，溶剂与橡胶塞接触，约有百分之二十到四十的内毒素丢失。解决此问题的方法是应将试剂直立地存放在无污染的瓶中，并规定在内毒素试验之前统一的混合步骤。
姜素云等[15]通过考察细菌内毒素的稳定性后发现，溶解后的细菌内毒素应用液（0.5-1.0Eu/ml）在0-4 ℃ 放置一周活性不变；1.0-20Eu 应用液若置冰箱，可冷冻保藏20天，但反复冻融活性会逐渐降低。
2 供试品
2.1 多糖[2]
我们已经知道每毫升含皮克级的内毒素会使鲎试剂呈阳性，而多于10pg/ml浓度的产碱杆菌多糖（1-3-β-D-葡聚糖）（curdlan，1-3-beta-D-glucan）也会使常规的内毒素实验呈阳性，因为LAL中含G因子[16]。
据报道[17][18]，能激活鲎试剂旁路（G 途径）的物质主要是（1-3）-β-D-葡聚糖（包括（1-4）-β-D-葡聚糖和（1-6）-β-D-葡聚糖）以及LAL-RM（LAL-Reaction Material）两类，如真菌多糖（Fugal polysaccharide）、中空纤维滤膜洗涤液、肾透析仪（人工肾，血液透析仪）洗涤液等。实验室常用的酒精，棉球等也含有较多的（1-3）-β-D-葡聚糖。低于一定浓度的（1-3）-β-D-葡聚糖或LAL-RM不足以使鲎试剂的凝集反应产生阳性结果，但如果有细菌内毒素共同作用的情况下，凝集反应会变得更为激烈和迅速，很容易使反应出现阳性结果。我国已生产出含有能抑制或阻断鲎试剂G因子旁路反应物质的试剂—增抗液（Antienhancement Solution）。
Cooper JF 和 Weary ME[19] 等学者发现商品的LAL试剂对葡聚糖的反应存在很大的差异，所以实验室间LAL实验的结果可能出现矛盾。动态LAL方法（Kinetic LAL methods）对筛选可能被葡聚糖污染了的物质非常有用。葡聚糖在非口服制剂中不常见，只限于被微生物或纤维素物质污染的产品。并设计了一种能确定葡聚糖存在与否的LAL试验方法。
另外，丹麦科学家[20]发现，细菌内毒素与鲎试剂的凝集反应可被二甲亚砜与多粘菌素B （dimethyl sulfoxide and polymyxin B）合用,或抗鲎C因子的单克隆抗体（monoclonal antibody against Limulus factor C）所抑制。他们还发现β-葡聚糖（beta-glucan）激活途径能完全被昆布糖（laminarin）所阻碍，而不影响内毒素的激活途径。人血浆与LAL反应是通过β-葡聚糖途径激活的，而非内毒素途径。
八十年代后，日本最先研制成功只与内毒素起反应的特异鲎试剂，如：Endospecy，以及只与（1-3）-β-葡聚糖反应的鲎试剂：SLP试剂及Gluspecy。[21]
2.2 蛋白
2.2.1 阳离子蛋白
几位德国科学家[21]发现阳离子蛋白（Cationic proteins）如溶菌酶、核糖核酸酶A、以及人的免疫球蛋白G（lysozyme, ribonuclease A, and human IgG）能够与细菌内毒素形成细菌内毒素-蛋白复合体，对细菌内毒素有显著的屏蔽作用，从而影响用鲎法来测定细菌内毒素。试验证明，苯酚提取法、稀释加热法、以及高氯酸处理（phenol extraction, dilution heating, and perchloric acid treatment）等方法都不能够解除此作用。胰岛素、糜蛋白酶、链酶蛋白酶（trypsin, chymotrypsin, or pronase）等只能回收10%-20%的内毒素，然而如在测定之前，用蛋白酶 K （proteinase K）来消化样品，可使细菌内毒素的回收率达到百分之百。进一步研究还发现，多聚-L-赖氨酸及多聚二甲亚胺（poly-L-lysine and poly ethyleneimine）作为细菌内毒素选择性配位基能够将细菌内毒素从所研究的蛋白上脱去，从而有利于进一步的测定。
2.2.2 血蛋白
Roth R与IKaca W 证明[23][24]，血红蛋白能与LPS结合，这种结合会改变LPS的一些物理特性，从而增强了LPS的生物学活性及LPS与LAL的作用。
据报道[2][17][18]：人血白蛋白、球蛋白、抗凝血酶Ⅲ均可以激活 G因子。有学者的研究表明用一般鲎试剂测定的人血白蛋白、球蛋白等血液制品的阳性检出率明显高于用去G因子LAL测定的阳性率,而后者与兔热源检查结果基本一致。
2.2.3 免疫蛋白
Baek L[25] 等人通过免疫电泳方法表明，假单孢绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）及金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）细胞膜的一些可溶性抗原（Soluble antigens）与LAL能够反应。
有的学者[26]用鼠单克隆免疫球蛋白M抗体E5（ mouse monoclonal IgM antibody E5）来测定其抗不同菌种LPS的活性。结果证明，由于细菌种类不同，经E5处理后，LPS活性减弱的程度也不同，一般地0.2mg/ml以上的E5能减少几乎所有被研究菌种的LPS对鲎试剂的活性。
另据报道 [18], 抗血友病球蛋白、免疫球蛋白也可激活 G 因子途径。
2.3 离子
离子对细菌内毒素测定结果影响较大[9]，因为一方面离子强度较大会引起内毒素的聚集，加重低浓度内毒素不易散的问题；另一方面LAL中的C因子必须在二价阳离子的参与下才能被激活形成活化C因子。
Guyomard S; Darbord JC [13][27]介绍了用五种内毒素，即2株大肠杆菌、1株沙门氏杆菌、1株灵杆菌、1株霍乱弧菌（Escherichia coli, Salmonella, Serratia marcescens and Vibrio cholerae)与FDA推荐的内毒素EC5作LAL实验的重现性。发现添加Mg2+增强了LAL显色反应（160mmol/l最佳），而Ca2+浓度大于5mmol/l时抑制了此反应，0.3mmol/l的Zn2+会强烈地抑制反应。由Zn2+的部分抑制作用能被增加Mg2+而减弱（160mmol/l）。当在反应的第一步（细菌内毒素与LAL孵育）时添加这些二价阳离子会改变LAL显色反应，而在反应的第二步，即加入生色底物（chromogenic substrate）时这些阳离子则不会改变LAL生色反应。
据报道[7]当鲎血被抽出后，用3% NaCl 充分稀释(1:500)能阻止变形细胞凝集，即使有内毒素存在也不凝聚，但当有钙或镁离子存在时则很快凝固，由此可知钙、镁离子对于鲎试验的作用，但是过量的钙离子又会影响凝聚作用的完成。因此,当溶液中有EDTA等络合剂或肝素钠、柠檬酸钠等抗凝剂存在时，Ca2+，Mg2+离子将失去作用[2][9]，从而影响本法的测定。
有人在研究内毒素的电催化特性对于鲎试验的影响时，证明钍与铁对内毒素的活性有强烈的影响，但由于其在鲎血中的含量甚微，故并不干扰实际测定。[7]
生理盐水中的 NaCl 对显色反应有干扰[28]，但关键在于稀释样品和标准品须用相同的无热源水或无热源生理盐水。相反,许多药物中含有的阴离子会吸收鲎试剂中的 Ca2+、Mg2+离子，使实验呈假阴性，可通过加入0.5mg/ml的氯化钙溶液，或22mg/ml的氯化镁溶液来排除干扰。[29]
2.4 有机盐
核酸钠（Sodium Nucleinate，NN）像细菌内毒素的LPS一样能够被LAL试验所检测，有学者[30]还比较了含有NN热原标准品的兔法与LAL法的测定结果。
2.5 透析液
Berland Y[31]总结了在文献报导中有关透析液细菌性污染的资料。透析液中的G-小分子热源物质能够透过正常的透析膜。纤维性透析膜(Cellulosic hemodialysis membranes)比合成膜(synthetic membranes)更容易通过内毒素。聚砜膜及聚酰胺膜(Polysulfone membranes and polyamide membranes)在透析液的那一面能够吸收内毒素。所以，鲎试验不能够检出污染透析液的所有细菌性物质。
Laude-Sharp M[32]等人的实验证明:在体内具有生物活性的多种LPS能够通过透析膜，尽管在血液中没有测到LAL反应物质，所以LAL法作为测定生物液(biological fluids)中是否存在LPS的标准不够充分。
日本学者 Yoshioka T [33]等人通过使用无G因子的凝集系统证明了从铜氨人造纤维膜(cuproammonium rayon membranes)得到的LAL反应物质不是内毒素，而是通过另一种途径使LAL凝集，此物质在循环中滞留相当长的时间。并发现在急性及慢性血液透析中，此反应物质平均水平为100-400pg/ml。
仲卫华[34]等的实验证明，血液透析液有一定的干扰作用，但可通过稀释法消除。
以上研究结果说明用鲎试剂来测定透析液中的内毒素的方法还有待于进一步的考察。
2.6 中药成分[21]
许多种中草药成分能够干扰LAL试验[35]，特别是清热解毒类药物[29]。
2.7 生化药品[21]
姜素云[2][36]等证明，氨基酸对鲎试剂有较强的抑制作用。
孔祥文[28]通过实验证明，基因工程蛋白类药物生产中常用的 2-巯基乙醇、2-巯疏糖醇和还原性谷胱甘肽对鲎试验呈色反应有干扰作用，当稀释到5.0μmol/l时,抑制作用近乎消除。
2.8 其它物质
另据报道[2][9][21][29]：人血中的多种凝血因子、可使蛋白质变性物质（乙醇、苯酚）或灭活的物质（如氧化剂、抗氧化剂、蛋白水解剂、专一失活剂等）、高糖溶液、络合物、电解质、维生素、添加剂、右旋糖酐-40、抗凝血剂如柠檬酸及肝磷脂等等，都可干扰鲎试剂形成凝胶。
3 鲎试剂与标准品
3.1 鲎试剂内源性因子
Roth RI与Tobias PS[37]在 研究含有能被细菌内毒素激发引起凝集反应的内毒素敏感因子的鲎试剂色析组份（chromatographic fraction of Limulus lysate）时,用了一种光复活性的、易解离的、放射性同位素标记（photoreactive, cleavable, radiolabeled）的沙门氏菌LPS衍生物（derivative of Salmonella minnesota LPS），LPS-（P-叠氮水杨酰胺）-1，3-二硫丙胺（LPS-(p-Azidosalicylamido)-1,3'-Dithiopropionamide ，LPS-ASD），来确定LPS-结合蛋白。结果证明LAL组分中较大的82-kDa蛋白是LPS结合蛋白，充当凝集反应的负调节因子，LAL组分中较小的50-kDa蛋白是对LPS敏感的凝集蛋白的选择物。
日本科学家[38][39][40]发现在日本马蹄蟹（horseshoe crab (Tachypleus tridentatus)）血细胞中存在鲎胞间凝集抑制物（Limulus Intracellular Coagulation Inhibitor，LICI）1型、2型、及3型。LICI-1专一性抑制对鲎LPS-敏感的丝氨酸蛋白酶（limulus lipopolysaccharide-sensitive serine protease），C因子（K1=2.5×106 M-1，S-1）；而LICI-2显著抑制鲎凝集酶（limulus clotting enzyme）（K1=4.3×105 M-1，S-1）；LICI-3强烈抑制对（1，3）-β-D葡聚糖敏感的丝氨酸蛋白酶（(1,3)-beta-D-glucan-sensitive serine protease），G因子（K1=3.9×105 M-1，S-1）。因此，鲎血淋巴凝结过程至少由三个内源性因子所调节：LICI-1 是Mr=48，000，有394个氨基酸的单链糖蛋白，其单一反应位点为-Arg-Ser-; LICI-2 是Mr=42，000，有386个氨基酸的单链糖蛋白，其单一反应位点为-Lys-Ser-; LICI-3 是Mr=53，000，有392个氨基酸的单链糖蛋白，其单一反应位点与LICI-1相同。
3.2 试剂质量
不同批号的鲎试剂标示值相同，但试验结果不尽相同，尤其是近效者的灵敏度有明显下降的趋势。所以在更换批号或者用近效期鲎试剂的时候，应对灵敏度进行复核。以确定本批鲎试剂的实际灵敏度。[3]
有的同志发现[11]：使用不同厂家生产的溶解水来溶解鲎试剂，结果会导致假阳性的出现，而使用同厂生产的鲎试剂及溶解水均符合规定。
另外，还有试验者发现[41][42][43]：不同厂家与批号的细菌内毒素工作标准品的灵敏度有很大的差别,有的竟低于50% 以下。支与支之间差异竟达50%。[10]
高丽云[44]在实验中发现如放置半年后重新标定, LAL灵敏度会下降,细菌内毒素工作标准品的效价低于标示量。这可能与细菌内毒素的处方、pH值、冷冻干燥过程以及冻干标准品中加入的如人清蛋白、乳糖、聚乙二醇等添加剂影响细菌内毒素的稳定性有关[2]。
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培养条件、操作环境可能引起各次实验之间、各实验室之间的结果差异[2]。
1.1 时间
鲎试剂在液态时极不稳定, 室温放置太久会影响反应灵敏度，故加样结束后,应立即放入恒温水浴中。 [3]延长保温时间，可提高LAL的灵敏度。[4]
有研究者[5]发现细菌内毒素国家标准品和工作标准品的不同混合时间与相对活性之间具有一定的规律，即５分钟时混合点的活性最强，混合时间越长，活性反而降低，但在三十分钟以内的各混合点测定的灵敏度均在规定范围之内。
在显色法中灵敏度与时间有关，故实验过程中既要严格控制每个环节的保温时间，又要严格控制终止时间[2][6][7]。
1.2 温度
凝胶试验规定的孵化温度为37℃。但在夏季高温季节，如果同时作几个样，阳性对照不成立的现象时有发生，故应改为冰浴。[3]
郭录平[4]通过实验证明，保温在25-41℃内，随着温度的升高，LAL的灵敏度也随着升高；在41-46℃之间，对灵敏度无明显影响；≥48℃会破坏鲎试剂。
另外在显色法中的灵敏度也与控制温度有关[6][7]。
1.3 pH值
高国政等人[8]用动态浊度法详细研究了样品pH 值对细菌内毒素测定的影响，结果发现：样品 pH 在6-8间实验结果稳定；pH ≤3 或≥12时，实验受到抑制，平均回收率≤56.8%。最后得出结论：使用TAL 时，供试品 pH 应预调在6.5-7.5 为好；使用 LAL 时，pH 应预调在6.2±0.1或 6.7-7.8为好。
也有人认为[4][7][9] 鲎试验的 pH 应为6.5-8.5，以7.0-7.5为佳。必要时可用无内毒素的 HCl 或NaOH 调节 pH 值[2]。
1.4 试验器具
内毒素稀释不宜用注射器，而应用经过校正的刻度吸管。因为注射器刻度不准，而且,针栓壁磨沙面易吸附内毒素而使其浓度不够,造成凝胶反应不成立[3][10]。
普通玻璃及塑料管也会影响实验结果[2][9]，用硬的玻璃管及AR玻璃管较为合适。一般硼酸玻璃管测得的效价较低,而且LAL的灵敏度愈低，管对测定的结果影
响愈大。操作中常用的聚丙烯塑料管可能干扰结果。
1.5 操作程序
有实验者发现[3][11]：操作次序也影响试验结果。应该先吸取供试品、然后加入阴性对照及阳性对照液，最后按供试品管、阳性对照管、阴性对照的顺序逐一精确加入鲎试剂。未按此程序容易出现阳性反应不成立的现象。
1.6 处理作用
Pedersen MR和Hansen EW[12] 将内毒素溶液用玻璃试管干燥，在氧丙环（Ethylene Oxide，EO）450或900mg/l中暴露1-46小时后，内毒素的LAL活性减少至百分之三十。将多粘菌素B（Polymyxin B，PB）加入到内毒素稀释液中会减少其活性百分之七十五。内毒素经过EO处理会减少LAL活性百分之七十，进一步加入PB会减少LAL的活性百分之九十九。EO对内毒素的反应会减少其LAL活性，也会减少其热源反应，增加与PB的亲和性。
Bamba T[13] 等学者研究了平滑型G-细菌的内毒素（Smooth gram-negative bacteria ，S-form)经过高温蒸气处理后的灭活效果，观察到不同种细菌的抗热性显著地不同，减弱率与浓度有关。低浓度（10ng/ml）内毒素处理后的活性可降低至可测定的限度下。粗糙型（Rough strains，R-form) 细菌的内毒素减弱时间曲线与个别平滑型相似。平滑型，尤其是Rc突变体（Rc mutant）细菌的内毒素灭活性能够被Mg2+，Ca2+等二价阳离子显著影响。
FDA认为不同的产品处理和储存条件可能会引起对某一样品试验的分析误差。Guilfoyle DE [14]等人通过实验发现培养细菌的培养基以及溶剂的储藏温度均不会引起任何问题。然而，因为溶液在瓶中没有充分震荡，溶剂与橡胶塞接触，约有百分之二十到四十的内毒素丢失。解决此问题的方法是应将试剂直立地存放在无污染的瓶中，并规定在内毒素试验之前统一的混合步骤。
姜素云等[15]通过考察细菌内毒素的稳定性后发现，溶解后的细菌内毒素应用液（0.5-1.0Eu/ml）在0-4 ℃ 放置一周活性不变；1.0-20Eu 应用液若置冰箱，可冷冻保藏20天，但反复冻融活性会逐渐降低。
2 供试品
2.1 多糖[2]
我们已经知道每毫升含皮克级的内毒素会使鲎试剂呈阳性，而多于10pg/ml浓度的产碱杆菌多糖（1-3-β-D-葡聚糖）（curdlan，1-3-beta-D-glucan）也会使常规的内毒素实验呈阳性，因为LAL中含G因子[16]。
据报道[17][18]，能激活鲎试剂旁路（G 途径）的物质主要是（1-3）-β-D-葡聚糖（包括（1-4）-β-D-葡聚糖和（1-6）-β-D-葡聚糖）以及LAL-RM（LAL-Reaction Material）两类，如真菌多糖（Fugal polysaccharide）、中空纤维滤膜洗涤液、肾透析仪（人工肾，血液透析仪）洗涤液等。实验室常用的酒精，棉球等也含有较多的（1-3）-β-D-葡聚糖。低于一定浓度的（1-3）-β-D-葡聚糖或LAL-RM不足以使鲎试剂的凝集反应产生阳性结果，但如果有细菌内毒素共同作用的情况下，凝集反应会变得更为激烈和迅速，很容易使反应出现阳性结果。我国已生产出含有能抑制或阻断鲎试剂G因子旁路反应物质的试剂—增抗液（Antienhancement Solution）。
Cooper JF 和 Weary ME[19] 等学者发现商品的LAL试剂对葡聚糖的反应存在很大的差异，所以实验室间LAL实验的结果可能出现矛盾。动态LAL方法（Kinetic LAL methods）对筛选可能被葡聚糖污染了的物质非常有用。葡聚糖在非口服制剂中不常见，只限于被微生物或纤维素物质污染的产品。并设计了一种能确定葡聚糖存在与否的LAL试验方法。
另外，丹麦科学家[20]发现，细菌内毒素与鲎试剂的凝集反应可被二甲亚砜与多粘菌素B （dimethyl sulfoxide and polymyxin B）合用,或抗鲎C因子的单克隆抗体（monoclonal antibody against Limulus factor C）所抑制。他们还发现β-葡聚糖（beta-glucan）激活途径能完全被昆布糖（laminarin）所阻碍，而不影响内毒素的激活途径。人血浆与LAL反应是通过β-葡聚糖途径激活的，而非内毒素途径。
八十年代后，日本最先研制成功只与内毒素起反应的特异鲎试剂，如：Endospecy，以及只与（1-3）-β-葡聚糖反应的鲎试剂：SLP试剂及Gluspecy。[21]
2.2 蛋白
2.2.1 阳离子蛋白
几位德国科学家[21]发现阳离子蛋白（Cationic proteins）如溶菌酶、核糖核酸酶A、以及人的免疫球蛋白G（lysozyme, ribonuclease A, and human IgG）能够与细菌内毒素形成细菌内毒素-蛋白复合体，对细菌内毒素有显著的屏蔽作用，从而影响用鲎法来测定细菌内毒素。试验证明，苯酚提取法、稀释加热法、以及高氯酸处理（phenol extraction, dilution heating, and perchloric acid treatment）等方法都不能够解除此作用。胰岛素、糜蛋白酶、链酶蛋白酶（trypsin, chymotrypsin, or pronase）等只能回收10%-20%的内毒素，然而如在测定之前，用蛋白酶 K （proteinase K）来消化样品，可使细菌内毒素的回收率达到百分之百。进一步研究还发现，多聚-L-赖氨酸及多聚二甲亚胺（poly-L-lysine and poly ethyleneimine）作为细菌内毒素选择性配位基能够将细菌内毒素从所研究的蛋白上脱去，从而有利于进一步的测定。
2.2.2 血蛋白
Roth R与IKaca W 证明[23][24]，血红蛋白能与LPS结合，这种结合会改变LPS的一些物理特性，从而增强了LPS的生物学活性及LPS与LAL的作用。
据报道[2][17][18]：人血白蛋白、球蛋白、抗凝血酶Ⅲ均可以激活 G因子。有学者的研究表明用一般鲎试剂测定的人血白蛋白、球蛋白等血液制品的阳性检出率明显高于用去G因子LAL测定的阳性率,而后者与兔热源检查结果基本一致。
2.2.3 免疫蛋白
Baek L[25] 等人通过免疫电泳方法表明，假单孢绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）及金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）细胞膜的一些可溶性抗原（Soluble antigens）与LAL能够反应。
有的学者[26]用鼠单克隆免疫球蛋白M抗体E5（ mouse monoclonal IgM antibody E5）来测定其抗不同菌种LPS的活性。结果证明，由于细菌种类不同，经E5处理后，LPS活性减弱的程度也不同，一般地0.2mg/ml以上的E5能减少几乎所有被研究菌种的LPS对鲎试剂的活性。
另据报道 [18], 抗血友病球蛋白、免疫球蛋白也可激活 G 因子途径。
2.3 离子
离子对细菌内毒素测定结果影响较大[9]，因为一方面离子强度较大会引起内毒素的聚集，加重低浓度内毒素不易散的问题；另一方面LAL中的C因子必须在二价阳离子的参与下才能被激活形成活化C因子。
Guyomard S; Darbord JC [13][27]介绍了用五种内毒素，即2株大肠杆菌、1株沙门氏杆菌、1株灵杆菌、1株霍乱弧菌（Escherichia coli, Salmonella, Serratia marcescens and Vibrio cholerae)与FDA推荐的内毒素EC5作LAL实验的重现性。发现添加Mg2+增强了LAL显色反应（160mmol/l最佳），而Ca2+浓度大于5mmol/l时抑制了此反应，0.3mmol/l的Zn2+会强烈地抑制反应。由Zn2+的部分抑制作用能被增加Mg2+而减弱（160mmol/l）。当在反应的第一步（细菌内毒素与LAL孵育）时添加这些二价阳离子会改变LAL显色反应，而在反应的第二步，即加入生色底物（chromogenic substrate）时这些阳离子则不会改变LAL生色反应。
据报道[7]当鲎血被抽出后，用3% NaCl 充分稀释(1:500)能阻止变形细胞凝集，即使有内毒素存在也不凝聚，但当有钙或镁离子存在时则很快凝固，由此可知钙、镁离子对于鲎试验的作用，但是过量的钙离子又会影响凝聚作用的完成。因此,当溶液中有EDTA等络合剂或肝素钠、柠檬酸钠等抗凝剂存在时，Ca2+，Mg2+离子将失去作用[2][9]，从而影响本法的测定。
有人在研究内毒素的电催化特性对于鲎试验的影响时，证明钍与铁对内毒素的活性有强烈的影响，但由于其在鲎血中的含量甚微，故并不干扰实际测定。[7]
生理盐水中的 NaCl 对显色反应有干扰[28]，但关键在于稀释样品和标准品须用相同的无热源水或无热源生理盐水。相反,许多药物中含有的阴离子会吸收鲎试剂中的 Ca2+、Mg2+离子，使实验呈假阴性，可通过加入0.5mg/ml的氯化钙溶液，或22mg/ml的氯化镁溶液来排除干扰。[29]
2.4 有机盐
核酸钠（Sodium Nucleinate，NN）像细菌内毒素的LPS一样能够被LAL试验所检测，有学者[30]还比较了含有NN热原标准品的兔法与LAL法的测定结果。
2.5 透析液
Berland Y[31]总结了在文献报导中有关透析液细菌性污染的资料。透析液中的G-小分子热源物质能够透过正常的透析膜。纤维性透析膜(Cellulosic hemodialysis membranes)比合成膜(synthetic membranes)更容易通过内毒素。聚砜膜及聚酰胺膜(Polysulfone membranes and polyamide membranes)在透析液的那一面能够吸收内毒素。所以，鲎试验不能够检出污染透析液的所有细菌性物质。
Laude-Sharp M[32]等人的实验证明:在体内具有生物活性的多种LPS能够通过透析膜，尽管在血液中没有测到LAL反应物质，所以LAL法作为测定生物液(biological fluids)中是否存在LPS的标准不够充分。
日本学者 Yoshioka T [33]等人通过使用无G因子的凝集系统证明了从铜氨人造纤维膜(cuproammonium rayon membranes)得到的LAL反应物质不是内毒素，而是通过另一种途径使LAL凝集，此物质在循环中滞留相当长的时间。并发现在急性及慢性血液透析中，此反应物质平均水平为100-400pg/ml。
仲卫华[34]等的实验证明，血液透析液有一定的干扰作用，但可通过稀释法消除。
以上研究结果说明用鲎试剂来测定透析液中的内毒素的方法还有待于进一步的考察。
2.6 中药成分[21]
许多种中草药成分能够干扰LAL试验[35]，特别是清热解毒类药物[29]。
2.7 生化药品[21]
姜素云[2][36]等证明，氨基酸对鲎试剂有较强的抑制作用。
孔祥文[28]通过实验证明，基因工程蛋白类药物生产中常用的 2-巯基乙醇、2-巯疏糖醇和还原性谷胱甘肽对鲎试验呈色反应有干扰作用，当稀释到5.0μmol/l时,抑制作用近乎消除。
2.8 其它物质
另据报道[2][9][21][29]：人血中的多种凝血因子、可使蛋白质变性物质（乙醇、苯酚）或灭活的物质（如氧化剂、抗氧化剂、蛋白水解剂、专一失活剂等）、高糖溶液、络合物、电解质、维生素、添加剂、右旋糖酐-40、抗凝血剂如柠檬酸及肝磷脂等等，都可干扰鲎试剂形成凝胶。
3 鲎试剂与标准品
3.1 鲎试剂内源性因子
Roth RI与Tobias PS[37]在 研究含有能被细菌内毒素激发引起凝集反应的内毒素敏感因子的鲎试剂色析组份（chromatographic fraction of Limulus lysate）时,用了一种光复活性的、易解离的、放射性同位素标记（photoreactive, cleavable, radiolabeled）的沙门氏菌LPS衍生物（derivative of Salmonella minnesota LPS），LPS-（P-叠氮水杨酰胺）-1，3-二硫丙胺（LPS-(p-Azidosalicylamido)-1,3'-Dithiopropionamide ，LPS-ASD），来确定LPS-结合蛋白。结果证明LAL组分中较大的82-kDa蛋白是LPS结合蛋白，充当凝集反应的负调节因子，LAL组分中较小的50-kDa蛋白是对LPS敏感的凝集蛋白的选择物。
日本科学家[38][39][40]发现在日本马蹄蟹（horseshoe crab (Tachypleus tridentatus)）血细胞中存在鲎胞间凝集抑制物（Limulus Intracellular Coagulation Inhibitor，LICI）1型、2型、及3型。LICI-1专一性抑制对鲎LPS-敏感的丝氨酸蛋白酶（limulus lipopolysaccharide-sensitive serine protease），C因子（K1=2.5×106 M-1，S-1）；而LICI-2显著抑制鲎凝集酶（limulus clotting enzyme）（K1=4.3×105 M-1，S-1）；LICI-3强烈抑制对（1，3）-β-D葡聚糖敏感的丝氨酸蛋白酶（(1,3)-beta-D-glucan-sensitive serine protease），G因子（K1=3.9×105 M-1，S-1）。因此，鲎血淋巴凝结过程至少由三个内源性因子所调节：LICI-1 是Mr=48，000，有394个氨基酸的单链糖蛋白，其单一反应位点为-Arg-Ser-; LICI-2 是Mr=42，000，有386个氨基酸的单链糖蛋白，其单一反应位点为-Lys-Ser-; LICI-3 是Mr=53，000，有392个氨基酸的单链糖蛋白，其单一反应位点与LICI-1相同。
3.2 试剂质量
不同批号的鲎试剂标示值相同，但试验结果不尽相同，尤其是近效者的灵敏度有明显下降的趋势。所以在更换批号或者用近效期鲎试剂的时候，应对灵敏度进行复核。以确定本批鲎试剂的实际灵敏度。[3]
有的同志发现[11]：使用不同厂家生产的溶解水来溶解鲎试剂，结果会导致假阳性的出现，而使用同厂生产的鲎试剂及溶解水均符合规定。
另外，还有试验者发现[41][42][43]：不同厂家与批号的细菌内毒素工作标准品的灵敏度有很大的差别,有的竟低于50% 以下。支与支之间差异竟达50%。[10]
高丽云[44]在实验中发现如放置半年后重新标定, LAL灵敏度会下降,细菌内毒素工作标准品的效价低于标示量。这可能与细菌内毒素的处方、pH值、冷冻干燥过程以及冻干标准品中加入的如人清蛋白、乳糖、聚乙二醇等添加剂影响细菌内毒素的稳定性有关[2]。
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注：本文发表在《药物分析杂志》1999.19卷增刊
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