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细菌内毒素检查中常遇的问题及解决方法（节选）
Date: 2017-07-25 10:12:53
细菌内毒素检查法的优越性已为大多数质检人员所体会和认识。但在实际工作中，也有一些问题使实验者感到困惑。因此，作者认为有必要对这些问题提出并加以探讨，供大家参考。
2. 阳性管（PC管）不凝，为什么？
主要有三个方面的原因。
⑴、 试剂问题〔包括内毒素和TAL〕。
多年以来，本公司TAL活性较稳定，其稳定性可达室温保存2-3 年；细菌内毒素亦具有一定耐热性，通常常温保存在其有效期内或运输其活性不受影响。但需注意的是，使用大装量的试剂较使用小装量的试剂容易导致PC管不凝的情况发生。这是由于大装量的试剂使用时需要分装，不能保证分装管符合使用所致。尽管如此，我们仍有理由相信在大多数情况下试剂不是造成PC管不凝的主要原因。
内毒素和检查用水交叉使用导致阳性对照不成立。部分用户使用鲎试剂厂家提供的细菌内毒素标准品做阳性对照，但在使用时鲎试剂、细菌内毒素标准品、及检查用水不是同一厂家的，这是目前阳性对照不成立的一个原因。我们在工作中发现，湛江博康海洋生物有限公司提供的细菌内毒素标准品、检查用水及试验耗材适用于国内国外的所有鲎试剂。许多客户在试验时忽略了这个问题，导致阳性对照不成立或灵敏度试验全部为阴性，查其原因，最终发现部分企业的细菌内毒素标准品、检查用水及试验耗材不适用于其它厂家的鲎试剂，特别是某“合资”企业的检查用水，这种现象最突出。
⑵、 实验条件问题。
①、器皿洗涤问题
2010年版《中国药品检验标准操作规范》311页——细菌内毒素检查法“实验准备”规定：“将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液沥干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器中，放置入烤箱中，除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素。”
按照2010年版《中国药典》凡例第二十二条规定“试验用水，除另有规定外，均系指纯化水。”应该特别注意，该规程明确规定最后冲洗玻璃器皿必须“用蒸馏水冲洗。”有的客户使用反渗透制备的纯化水冲洗试验用玻璃器皿，结果试验中所有的阳性对照都为阴性，复核鲎试剂灵敏度时试验结果误差较大，这主要是由于纯化水和蒸馏水的制备方法不同所造成的。由于制备方法不同，纯化水中存在的阴阳离子经250℃高温干烤不可能被破坏，这些离子对鲎试剂酶反应有较强的抑制作用，导致阳性对照不成立，灵敏度复核结果也不成立。这是目前所知阳性对照不成立和灵敏度复核结果不成立的主要原因。
②、保温问题
个别单位发现PC管不凝后，把TAL及内毒素拿到本实验室再进行试验，结果PC管凝得很好。但是，当我们到外单位就地进行细菌内毒素试验时，却在2个实验室发现过PC管不凝的情况。究其原因，认为保温环节出问题的可能性最大。一次是保温过程中水浴箱电源插座接触不良，恒温不能保证；另一次是某单位使用无盖式恒温水浴锅代替有盖式电热恒温水浴箱，水表层的温度可能并未达到37℃。由于TAL的成胶时间与温度在一定的范围内呈负相关。温度偏低将使成胶时间延长。这样，在规定的时间里PC管不凝也就不足为奇了。造成水浴温度实际偏低的另一原因，还可能是因为实验者把温度计放在发热管附近监测反应温度所致。我们主张采用电热恒温水浴箱上的水银温度计监测反应温度。精确的控温是试验取得准确结果的重要保证。
③、保温设备问题
2010年版《中国药品检验标准操作规范》要求细菌内毒素检查法恒温设备可用“恒温水浴箱或适宜的恒温器，可设定保温温度在37℃±1℃”。部分实验室将鲎试剂放在微生物培养箱或鼓风电热恒温箱中37℃恒温60分钟，观察结果时发现阳性对照不成立，灵敏度复核结果也不成立。2010年版《中国药品检验标准操作规范》要求“由于凝集反应是不可逆的，所以在反应过程中及观察结果时应注意不要使试管受到振动，以免使凝胶破碎产生假阴性结果。”部分客户坚持认为反应过程中及观察结果时他们没有使试管受到振动，但忽略了微生物培养箱或鼓风电热恒温箱中的热空气一直处于循环状态，鲎试剂安瓿很轻，在热空气循环安瓿过程中一直处于振动状态，这是典型的假阴性结果。我们推荐一款仪器，ET-96内毒素凝胶法测定仪，该仪器专门用于细菌内毒素检查的凝胶法试验，完全符合《中国药典》要求，仪器提供96个检测孔，可直接插入鲎试剂安瓿，96个检测孔分为12组，每组单独定时，样品加样后直接放入仪器，并开始60分钟的定时保温，避免不同样品之间加样后放入保温装置的时间差带来的不准确性。
实验室环境
为保证实验结果的准确性，防止污染，内毒素检查实验应在密闭的洁净室中或密闭实验室的超净工作台下进行。细菌内毒素试验尽可能设立独立实验室，不要与其它试验共用同一实验室。
⑶、 操作问题。
①、内毒素开启
细菌内毒素标准品只能在安瓿的易折点上部开启内毒素，不能沿易折点开启，防止振荡过程中内毒素粘在封口膜上。封口膜或医用胶布成份复杂，与内毒素溶液接触后，有部分内溶物溶于溶液中，产生增强或抑制作用。
内毒素振荡问题
此外，操作上我们还应注意内毒素的溶解稀释过程要按药典的规定进行，振荡的时间及强度要保证，使内毒素溶液均匀稳定，内毒素分子充分分散。
②、鲎试剂开启时间
操作时严格按操作规程进行，安瓿开启前应先用酒精棉球擦拭曲颈部，用将颈部折断，防止碎玻屑掉入安瓿内。在鲎试剂的溶解、样品的稀释及加样时，取样均应准确。如果一人独立完成试验，可先稀释配制好内毒素标准溶液和样品溶液，最后开启复溶鲎试剂，尽可能缩短鲎试剂溶液暴露在空气中的时间（最好控制在15分钟内）。酒精棉球擦拭曲颈部将酒精棉球捏干，安瓿曲颈部不要残留有明显的酒精，酒精进入鲎试剂安瓿内有很强的抑制作用，同时酒精能溶解凝胶。这也是导致阳性不成立的一个因素。
2. 阳性管（PC管）不凝，为什么？
主要有三个方面的原因。
⑴、 试剂问题〔包括内毒素和TAL〕。
多年以来，本公司TAL活性较稳定，其稳定性可达室温保存2-3 年；细菌内毒素亦具有一定耐热性，通常常温保存在其有效期内或运输其活性不受影响。但需注意的是，使用大装量的试剂较使用小装量的试剂容易导致PC管不凝的情况发生。这是由于大装量的试剂使用时需要分装，不能保证分装管符合使用所致。尽管如此，我们仍有理由相信在大多数情况下试剂不是造成PC管不凝的主要原因。
内毒素和检查用水交叉使用导致阳性对照不成立。部分用户使用鲎试剂厂家提供的细菌内毒素标准品做阳性对照，但在使用时鲎试剂、细菌内毒素标准品、及检查用水不是同一厂家的，这是目前阳性对照不成立的一个原因。我们在工作中发现，湛江博康海洋生物有限公司提供的细菌内毒素标准品、检查用水及试验耗材适用于国内国外的所有鲎试剂。许多客户在试验时忽略了这个问题，导致阳性对照不成立或灵敏度试验全部为阴性，查其原因，最终发现部分企业的细菌内毒素标准品、检查用水及试验耗材不适用于其它厂家的鲎试剂，特别是某“合资”企业的检查用水，这种现象最突出。
⑵、 实验条件问题。
①、器皿洗涤问题
2010年版《中国药品检验标准操作规范》311页——细菌内毒素检查法“实验准备”规定：“将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液沥干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器中，放置入烤箱中，除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素。”
按照2010年版《中国药典》凡例第二十二条规定“试验用水，除另有规定外，均系指纯化水。”应该特别注意，该规程明确规定最后冲洗玻璃器皿必须“用蒸馏水冲洗。”有的客户使用反渗透制备的纯化水冲洗试验用玻璃器皿，结果试验中所有的阳性对照都为阴性，复核鲎试剂灵敏度时试验结果误差较大，这主要是由于纯化水和蒸馏水的制备方法不同所造成的。由于制备方法不同，纯化水中存在的阴阳离子经250℃高温干烤不可能被破坏，这些离子对鲎试剂酶反应有较强的抑制作用，导致阳性对照不成立，灵敏度复核结果也不成立。这是目前所知阳性对照不成立和灵敏度复核结果不成立的主要原因。
②、保温问题
个别单位发现PC管不凝后，把TAL及内毒素拿到本实验室再进行试验，结果PC管凝得很好。但是，当我们到外单位就地进行细菌内毒素试验时，却在2个实验室发现过PC管不凝的情况。究其原因，认为保温环节出问题的可能性最大。一次是保温过程中水浴箱电源插座接触不良，恒温不能保证；另一次是某单位使用无盖式恒温水浴锅代替有盖式电热恒温水浴箱，水表层的温度可能并未达到37℃。由于TAL的成胶时间与温度在一定的范围内呈负相关。温度偏低将使成胶时间延长。这样，在规定的时间里PC管不凝也就不足为奇了。造成水浴温度实际偏低的另一原因，还可能是因为实验者把温度计放在发热管附近监测反应温度所致。我们主张采用电热恒温水浴箱上的水银温度计监测反应温度。精确的控温是试验取得准确结果的重要保证。
③、保温设备问题
2010年版《中国药品检验标准操作规范》要求细菌内毒素检查法恒温设备可用“恒温水浴箱或适宜的恒温器，可设定保温温度在37℃±1℃”。部分实验室将鲎试剂放在微生物培养箱或鼓风电热恒温箱中37℃恒温60分钟，观察结果时发现阳性对照不成立，灵敏度复核结果也不成立。2010年版《中国药品检验标准操作规范》要求“由于凝集反应是不可逆的，所以在反应过程中及观察结果时应注意不要使试管受到振动，以免使凝胶破碎产生假阴性结果。”部分客户坚持认为反应过程中及观察结果时他们没有使试管受到振动，但忽略了微生物培养箱或鼓风电热恒温箱中的热空气一直处于循环状态，鲎试剂安瓿很轻，在热空气循环安瓿过程中一直处于振动状态，这是典型的假阴性结果。我们推荐一款仪器，ET-96内毒素凝胶法测定仪，该仪器专门用于细菌内毒素检查的凝胶法试验，完全符合《中国药典》要求，仪器提供96个检测孔，可直接插入鲎试剂安瓿，96个检测孔分为12组，每组单独定时，样品加样后直接放入仪器，并开始60分钟的定时保温，避免不同样品之间加样后放入保温装置的时间差带来的不准确性。
实验室环境
为保证实验结果的准确性，防止污染，内毒素检查实验应在密闭的洁净室中或密闭实验室的超净工作台下进行。细菌内毒素试验尽可能设立独立实验室，不要与其它试验共用同一实验室。
⑶、 操作问题。
①、内毒素开启
细菌内毒素标准品只能在安瓿的易折点上部开启内毒素，不能沿易折点开启，防止振荡过程中内毒素粘在封口膜上。封口膜或医用胶布成份复杂，与内毒素溶液接触后，有部分内溶物溶于溶液中，产生增强或抑制作用。
内毒素振荡问题
此外，操作上我们还应注意内毒素的溶解稀释过程要按药典的规定进行，振荡的时间及强度要保证，使内毒素溶液均匀稳定，内毒素分子充分分散。
②、鲎试剂开启时间
操作时严格按操作规程进行，安瓿开启前应先用酒精棉球擦拭曲颈部，用将颈部折断，防止碎玻屑掉入安瓿内。在鲎试剂的溶解、样品的稀释及加样时，取样均应准确。如果一人独立完成试验，可先稀释配制好内毒素标准溶液和样品溶液，最后开启复溶鲎试剂，尽可能缩短鲎试剂溶液暴露在空气中的时间（最好控制在15分钟内）。酒精棉球擦拭曲颈部将酒精棉球捏干，安瓿曲颈部不要残留有明显的酒精，酒精进入鲎试剂安瓿内有很强的抑制作用，同时酒精能溶解凝胶。这也是导致阳性不成立的一个因素。
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