血液中细菌内毒素定量分析指南

湛江海洋生物制品厂——莫水晶

    近10多年来，科学家们对细菌内毒素（Endotoxin,ET）的研究已步至一个高峰期。尤其在近年的许多研究报告表明，这种ET物质对人体健康的危害性很大，可导致内脏（肝、胰腺、肾、肺、心脏等）重要器官发生功能障碍或功能衰竭。而这种临床症状的发生、发展或轻重与血浆中的ET水平高低相符合。并且有文献报道，腹腔注射脂多糖(LPS)小鼠血浆TNFa 明显升高，同时肝脏肿瘤坏死因子(TNFa Mrna)表达升高明显。在不同区域生活的人群都有可能因机体组织创伤、烧伤感染和消化系（肠道）炎症，使ET随渗液进入血液循环。当肌组织病灶继发感染时，因细菌的代谢（或用药）死亡又裂解稀放出大量LPS而导致内毒素血症（ETM）的形成。所以，对ETM不及时发现或被延误治疗，便危及身体的健康… …
　　为了尽早地发现和监测人体液中ET水平的动态变化，对辅助疾病的诊断和指导临床合理使用药物，提高治疗治愈率具有重要意义。我们研制的"细菌内毒素定量分析--鲎试剂盒"已成为医生的好帮手，也是制药企业和药品检验机构用于药品质量监控，避免ET进入体液循环，确保人民的身体健康具有重要的科学研究价值。

一、细菌内毒素定量分析鲎试剂盒

1、组成：定量法鲎试剂；细菌内毒素工作标准品；细菌内毒素检查用水；血液内毒素提取剂Ⅰ号；血液内毒素提取剂Ⅱ号。

2、用途：用于临床病人血液内毒素的提取、定量分析。

二、使用指南

（一）、试验材料及用具

1、细菌内毒素定量测定仪  天津大学无限电厂生产的BET-32。

2、电热干烤箱   除外源性内毒素用，温度应能维持250℃以上至少一小时。

3、旋涡混合器

4、鲎试剂，应具有国家主管部门的批准文号。

5、血液内毒素提取剂  湛江海洋生物制品厂生产。

6、细菌内毒素国家标准品（NSE），细菌内毒素工作标准品（WSE），除另有规定外应由中国药品生物制品检定所统一发放。

7、细菌内毒素检查用水（BET水）   系指与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37±1℃条件下不产生凝集反应的灭菌注射用水。

8、实验用具   移液管（或刻度吸管、定量移液器）、凝集管（10×75mm）、三角瓶、小试管（16×100mm）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、砂轮。所用玻璃器皿须经250℃干烤至少1小时。

9、试剂   75%乙醇、蒸馏水、铬酸洗液。

注：细菌内毒素定量分析鲎试剂盒包括以上材料中的4、5、6和7。

（二）、 实验操作

　1、Ⅰ号管供试品制做：
在样品采集管外壁注明病人姓名或编号，然后分别向管内加入Ⅰ号体液处理液1ml和待检全血1ml混匀，并密封管口移置离心机离心（3000转/分）10分钟，制成二倍稀释液备用。
　2、Ⅱ号管供试品制做：
分别吸取Ⅰ号管供试品上清液1ml和吸取Ⅱ号体液处理液1ml注入Ⅱ号管相混匀，并移置恒温水浴（60-65℃）中加热10分钟（加热时不必封闭管口避免蒸汽或水珠流入样品内），加热完毕用封口膜密封管口离心（4200转/分）10分钟，制成四倍稀释液备用。
　3、Ⅲ号管供试品制做：
　　根据Ⅰ号管样品例数，取稀释管若干支，并在试管外壁注明样品供给者姓名与Ⅱ号管相对应。然后分别吸取细菌内毒素检查用水0.6 ml，吸取Ⅱ号管的上清液0.6 ml注入Ⅲ号管内，并移置旋涡混合器上振荡30秒，制成八倍稀释液备用。
　4、鲎试剂溶液的制备：
    从鲎试剂盒中取出鲎试剂、BET检查用水，分别消毒安瓶曲颈部后启开，并按鲎试剂标示量吸取BET检查用水注入鲎试剂瓶内静置2分钟，待浸润溶解后混匀备用。
  5、实验加样：
　　上述准备工作完毕，取定量分析仪专用试管（注明编号与样品供给者相对应），然后分别将鲎试剂溶液（每管0.1ml）和Ⅲ号管中的供试品（每管0.20ml）分装到专用试管中，密封试管口并移置BET检测系统自动分析即可。
三、注意事项：
　　1）、 本实验的全过程要求无菌操作。
　　2）、 使用器具要求除菌除热原。厂家提供的专用器具，必要时放在干热恒温箱干烤（250℃）60分钟，待冷却后使用。
　　3）、 加入Ⅰ号管的供试品或血液，在60分钟内不能及时处理时，应放在低温冰箱中（0℃以下）保存，但时间不宜超出18小时。
　　4）、 Ⅱ号管供试品在加热时，不完全密封试管口，应在洁净室内操作避免污染。离心后得到的上清液在低温（0℃以下）条件下，在三天内可做复检之用。
　　5）、 本实验尽可能宿短操作时间，尤其鲎试剂溶解后应在10分钟内加样完毕，避免误差。
　　6）、 本实验需要做标准曲线时，应选用中国药品生物制品检定所提供的细菌内毒素标准品。

2003年12月1日