一、试剂和样品：

鲎试剂（批号：040203 灵敏度：0.125EU/ml；批号：040210 灵敏度：0.06EU/ml 湛江博康海洋生物有限公司生产）

细菌内毒素工作标准品（内毒素工作标准品2003-10，200EU/支，中国药品生物制品检定所提供）

碱性调节剂 (规格：2ml/支，批号：030704  无菌无内毒素试剂，湛江博康海洋生物有限公司配制)

注射用盐酸头孢吡肟（规格：原料药  批号：20040317 生产厂家：深圳信立泰药业有限公司 PH值为1.6-1.8）

二、干扰实验：

（一）、限值的确定：

L=0.04EU/mg（深圳信立泰药业有限公司提供）。

（二）、干扰试验浓度的计算：

对于固体粉末类药品，我们直接通过对内毒素限值表达方式的变换，就可以得到干扰试验用的药品浓度，而不必用MVD公式计算。本试验样品为注射用无菌原料药，MVD取1计算供试品的最小有效稀释浓度C=λ/L，试验选用灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂进行干扰试验。

C=λ/L

 =0.06/0.04

 =1.5mg/ml

（三）、预试验及其结果

称取一定量的样品，直接用检查用水溶解样品后做预试验，结果如下表。

表  未调PH值的预试验结果

样品溶液酸性较强，试验结果表现出很强的抑制作用，不能做细菌内毒素检查。必须对过酸的样品溶液调节样品PH值，可使用本公司生产的酸碱调节剂调节PH值在6.0-8.0的范围内。

2、供试品溶液的制备

首先称两份样品注射用盐酸头孢吡肟，称量过程必须严格无菌操作避免样品被污染。

取其中一份样品用来调节PH值，调节方法参考酸碱滴定法，滴定到达终点时记录下所用碱性调节剂的用量。然后计算样品注射用盐酸头孢吡肟和碱性调节剂的用量比例R。

取另一份注射用盐酸头孢吡肟按照以上计算的比例R加入一定量的碱性调节剂即可。配制时须用已除内毒素的容器，用碱性调节剂直接将其溶解到5.66mg/ml-6.25mg/ml可用于细菌内毒素检查。建议配制浓度为6.25mg/ml的溶液做细菌内毒素检查，然后用细菌内毒素检查用水，将以上样品溶液稀释到3.12mg/ml和1.56mg/ml备用。操作过程必须严格无菌操作，避免外源内毒素的污染。

（四）干扰试验

1、预试验：

用碱性调节剂溶解样品后做预试验，结果如下表。

表  调PH值后的预试验结果

结果符合要求，该样品只能先经过调酸后才能用于细菌内毒素检查。

2、鲎试剂灵敏度的对照系列：

根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml和0.015EU/ml等5个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。

3、样品干扰试验溶液的制备方法：

（1）、样品浓度为6.25mg/ml的干扰试验溶液制备方法：用已经配制好的6.25mg/ml注射用盐酸头孢吡肟溶液稀释内毒素标准品，制成为0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml和0.015EU/ml的含样品注射用盐酸头孢吡肟浓度为6.25mg/ml的标准内毒素对照溶液。

（2）、样品浓度为3.13mg/ml的干扰试验溶液制备方法：取注射用盐酸头孢吡肟的6.25mg/ml稀释液1.0ml加入试管中，然后吸取相同体积的内毒素标准溶液（浓度为0.25EU/ml）加入同一试管中，混合均匀即得到含内毒素为0.125EU/ml同时含样品注射用盐酸头孢吡肟为3.13mg/ml的混合液。然后用样品注射用盐酸头孢吡肟的3.13mg/ml稀释液稀释该混合液，稀释倍数依次为2、4和8倍，将这三支管混合均匀即可得到含内毒素分别为0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml和0.015EU/ml和含样品溶液浓度为3.13mg/ml的标准内毒素对照溶液。

（3）、样品浓度为1.56mg/ml的干扰试验溶液制备方法：取注射用盐酸头孢吡肟的3.13mg/ml稀释液1.0ml加入试管中，然后吸取相同体积的内毒素标准溶液（浓度为0.25EU/ml）加入同一试管中，混合均匀即可得到含内毒素为0.125EU/ml并同时含样品注射用盐酸头孢吡肟为1.56mg/ml的混合液。然后用样品注射用盐酸头孢吡肟的1.56mg/ml稀释液稀释该混合液，稀释倍数依次为2、4和8倍，将这三支管混合均匀即可得到含内毒素分别为0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml和0.015EU/ml和含样品溶液浓度为1.56mg/ml的标准内毒素对照溶液。

（四）、干扰试验加样方法参考中国药典2005版细菌内毒素检查法。

（五）、试验结果：

1、结果记录(TAL: 040210，0.06EU/ml，样品浓度C为6.25mg/ml)

2、结果记录(TAL: 040210，0.06EU/ml，样品浓度C为3.13mg/ml)

3、结果记录(TAL: 040210，0.06EU/ml，样品浓度C为1.56mg/ml)

结论依据中国药典附录“细菌内毒素检查法”，注射用盐酸头孢吡肟经调PH后可用于细菌内毒素检查，其干扰试验样品浓度6.25mg/ml、3.13mg/ml和1.56mg/ml符合试验要求，对鲎试验没有干扰。

三、样品常规检查

建议用注射用盐酸头孢吡肟溶液浓度C为3.12mg/ml，TAL（λ为0.125EU/ml）。

（一）、供试品溶液的制备：

首先，用碱性调节剂(无菌无内毒素)将样品注射用盐酸头孢吡肟溶解为浓度6.25mg/ml溶液，然后用细菌内毒素检查用水稀释到3.12mg/ml备用。

按操作规程制备细菌内毒素工作标准品溶液0.5EU/ml和0.25EU/ml，备用。

1、供试品阳性对照：（做2管）

取注射用盐酸头孢吡肟的6.25mg/ml稀释液和浓度为0.5EU/ml的内毒素稀释液各0.5ml混合均匀，分别取该混合液0.1ml加入2支已经复溶好的鲎试剂（λ=0.125EU/ml）中即可。

2、阳性对照：（做2管）

分别取0.1ml浓度为0.25EU/ml的内毒素稀释液加入2支已经复溶好的鲎试剂（λ=0.125EU/ml）中即可。

3、供试品溶液：（做2管）

分别取0.1ml注射用盐酸头孢吡肟的3.12mg/ml稀释液加入2支已经复溶好的鲎试剂（λ=0.125EU/ml）中即可。

4、阴性对照：（做2管）

分别取0.1ml细菌内毒素检查用水加入2支已经复溶好的鲎试剂（λ=0.125EU/ml）中即可。

（二）、结果

表  限量检查结果

　

结论：该批样品注射用盐酸头孢吡肟细菌内毒素检查符合规定。

说明：选用湛江博康海洋生物有限公司生产的碱性调节剂和鲎试剂，本文具有很好的参考价值；如果选用其他公司生产的产品，请自行重新试验。

 

 

  讨论：

1、鲎试剂与内毒素反应的最适宜pH在6.5-8.0；pH≤3 或≥10时，酶活性受到抑制。PH过高或过低会改变酶的活性，甚至改变整个酶分子的构像使其变性失活。故鲎试验，对供试品 pH 最好应预调和至6.5-8.0 为好。美国、日本药局方以及中国药典故规定检品必须调节PH值6.0-8.0。

2、双份调酸法可以防止样品被污染。

3、碱性调节剂的PH值既不能太高也不能太低。太高可能破坏样品中已存在的内毒素，使检测结果偏低；太低样品所用碱性调节剂的剂量太大，使用不方便。

4、固体无菌粉末类原料药计算样品浓度时，要注意纯度和水份的影响。本文作者因无法得到以上数据，因此计算浓度时忽略了纯度和水份的影响。

　

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